Effet inhibiteur de la lumière laser de 405 nm sur le biofilm bactérien dans le stent urétral

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 3908 (2023) Citer cet article

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L'utilisation clinique des stents urétraux est généralement compliquée par divers effets indésirables, notamment la dysurie, la fièvre et les infections des voies urinaires (UTI). Les biofilms (formés par des bactéries, telles que Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa et Staphylococcus aureus) adhérant au stent provoquent des infections urinaires chez les patients porteurs d'un stent (environ 11 %). Les conséquences indésirables de l'utilisation d'antibiotiques comprennent la résistance bactérienne, la prise de poids et le diabète de type 1, qui surviennent lorsque les antibiotiques sont utilisés pendant une longue période. Nous avons cherché à évaluer l'efficacité d'un nouveau traitement optique avec un laser à 405 nm pour inhiber la croissance bactérienne dans un stent urétral in vitro. Le stent urétral a été cultivé dans un bouillon de S. aureus pendant trois jours pour induire la formation de biofilm dans des conditions dynamiques. Différents temps d'irradiation avec la lumière laser à 405 nm ont été testés (5, 10 et 15 min). L'efficacité du traitement optique sur les biofilms a été évaluée quantitativement et qualitativement. La production d'espèces réactives de l'oxygène a aidé à éliminer le biofilm sur le stent urétral après irradiation à 405 nm. Le taux d'inhibition correspondait à une réduction de 2,2 log des unités formant colonies/mL de bactéries après 0,3 W/cm2 d'irradiation pendant 10 min. Le stent traité a montré une réduction significative de la formation de biofilm par rapport au stent non traité, comme démontré par la coloration au SYTO 9 et à l'iodure de propidium. Les tests MTT utilisant la lignée cellulaire CCD-986sk n'ont révélé aucune toxicité après 10 min d'irradiation. Nous concluons que le traitement optique avec une lumière laser de 405 nm inhibe la croissance bactérienne dans les stents urétraux avec une toxicité nulle ou minimale.

Les stents urétraux (US) sont utilisés pour traiter l'obstruction de la sortie de la vessie causée par diverses maladies. La sténose urétrale, l'hyperplasie bénigne de la prostate (HBP) et la dyssynergie du sphincter du détrusor (DSD) sont des indications pour l'insertion échographique chez les patients éligibles1. En règle générale, l'échographie est constituée d'un alliage métallique (nitinol), de matériaux polymères ou d'un matériau biodégradable suffisamment robuste pour maintenir la perméabilité urétrale. Culha et al. ont rapporté une efficacité US à long terme de 63% chez les patients présentant des sténoses urétrales récurrentes2. Par conséquent, le résultat infructueux de l'insertion du stent, tel que la migration du stent, l'incrustation, l'infection urinaire chronique, la douleur urétrale et la resténose, sont les complications du placement du stent3. Riedl et al. ont découvert que tous les patients porteurs d'endoprothèses chroniques à demeure présentaient une colonisation de l'endoprothèse et une bactériurie. Les stents temporaires sont également largement colonisés, avec un taux de survenue de 69 %, et 45 % des patients sont touchés par la bactériurie ; une telle colonisation microbienne provoque UTI4. Les infections urinaires sont causées par des bactéries Gram-positives et négatives, telles que Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Enterococcus faecalis et Staphylococcus aureus (S. aureus), et certains champignons5.

Une infection urinaire peut survenir lorsque des US stériles sont implantées dans le corps humain. Le biofilm fait référence à une accumulation de bactéries et de leurs sous-produits extracellulaires qui forment une communauté organisée à la surface6. La croissance du biofilm a un impact significatif sur les objets étrangers ou les équipements implantés dans le corps humain. Un large éventail de corps étrangers, tels que les échographies, les dispositifs implantables, les bandelettes, ont été développés pour des applications urologiques au cours des dernières décennies6. Ainsi, à la surface d'un implant, les biofilms sont hautement structurés et comprennent des populations en croissance active de bactéries, de protéines et de polymères extracellulaires. La formation accrue de biofilm peut entraîner une résistance bactérienne aux antibiotiques et des infections chroniques7.

Actuellement, les antibiotiques et les revêtements de surface des stents sont utilisés pour prévenir les infections urinaires8. Bien que la plupart des antibiotiques soient courants, certains antimicrobiens peuvent avoir des effets secondaires s'ils sont utilisés pendant une longue période9. Les risques liés à l'utilisation d'antibiotiques comprennent la résistance bactérienne, l'obésité et le diabète10. Les effets indésirables de l'utilisation d'antibiotiques peuvent inclure une malabsorption entraînant une maladie de type cœliaque, une réduction de l'absorption des médicaments, une altération du métabolisme et de l'absorption des vitamines, une colonisation par des organismes résistants et une sensibilité altérée aux infections11. L'application laser pour l'inhibition bactérienne via des fibres optiques attire l'attention en tant que méthode alternative pour résoudre ces problèmes12,13.

Une large gamme de longueurs d'onde peut être appliquée (de 400 à 1000 nm), et parmi les longueurs d'onde, la lumière bleue a montré son efficacité pour réduire la viabilité d'une variété d'espèces bactériennes, y compris S. aureus résistant à la méthicilline (SARM), Helicobacter pylori, Porphyromonas gingivalis et Pseudomonas aeruginosa, tandis que la plupart des spectres à haute irradiance sont capables de tuer les bactéries par effet photothermique même avec une faible irradiance1 4,15. Une autre source laser, telle que la lumière ultraviolette (UV), est également bien reconnue comme bactéricide. Cependant, en raison des effets cytotoxiques sur les tissus des mammifères, l'utilisation in vivo de la lumière UV est restreinte16. Dai, et al. ont découvert une perte de 57 % de kératinocytes lors de recherches sur la thérapie par la lumière UV pour les infections du cathéter central14. Cette cytotoxicité indique qu'en dépit d'être un agent antimicrobien efficace, l'application de la lumière UV peut ne pas être le choix idéal pour les tissus vivants17. Ainsi, la lumière laser à 405 nm (lumière bleue) a été largement utilisée pour la désinfection bactérienne18,19. Maclean et al. ont convenu que les dommages oxydatifs aux bactéries et la photoexcitation des porphyrines à la longueur d'onde de 405 nm pourraient générer l'activité germicide la plus élevée20,21. De plus, les porphyrines et autres substances photoactives peuvent décontaminer les bactéries en générant des espèces réactives de l'oxygène (ROS) à la suite de l'absorption de la lumière à 405 nm. Les ROS sont une classe de radicaux libres comprenant l'oxygène singulet, l'anion superoxyde, le peroxyde d'hydrogène et les radicaux hydroxyle. Lors de la cytotoxicité bactérienne, sous l'exposition à la lumière bleu-violet (405 nm), les molécules photosensibilisantes endogènes (porphyrines) sont photo-excitées et génèrent des ROS. La production suffisante de ROS conduit à une lyse cellulaire via le stress oxydatif. En général, la production de ROS dans les bactéries implique deux voies au cours de la thérapie photodynamique (PDT) : Type 1 et Type 2. Dans le type 1, la porphyrine endogène réagit directement avec les composants cellulaires, notamment les protéines, les lipides, les acides nucléiques et d'autres micromolécules, pour générer un anion superoxyde et un radical hydroxyle, qui, à leur tour, conduisent à la production d'autres molécules ROS. Dans le type 2, la porphyrine se lie à l'oxygène moléculaire pour former de l'oxygène singulet. Ce mécanisme conduit ensuite à des dommages oxydatifs sur les cellules bactériennes exposées à la lumière et provoque la mort cellulaire21,22. D'autres mécanismes, tels que la perturbation des membranes bactériennes et les dommages à l'ADN, ont été signalés comme étant les effets de la lumière bleue23.

Bien que des antibiotiques aient été utilisés pour traiter les infections urinaires, le médicament actuel est toujours associé à divers effets secondaires, tels que l'obésité et la résistance bactérienne. L'objectif de la présente étude était d'examiner un traitement alternatif pour les infections urinaires en irradiant une lumière laser sur le biofilm bactérien cultivé aux États-Unis via un dispositif optique. Il a été émis l'hypothèse que l'utilisation d'une lumière laser de 405 nm pourrait inhiber le biofilm bactérien en tant que photothérapie chez les patients porteurs d'un stent pour prévenir les infections urinaires. Cette étude in vitro a été conçue comme une première étape d'investigation pour le traitement alternatif des infections urinaires. Un laser à 405 nm d'un dispositif optique intégré au panier a été utilisé pour fournir de la lumière sur la surface intérieure des États-Unis. Pour les évaluations de sécurité, des tests MTT ont été utilisés pour évaluer l'effet de la lumière laser à 405 nm en tant qu'agent photothérapeutique pour inhiber la formation de biofilm bactérien dans les lignées cellulaires humaines. Le traitement optique proposé peut être un traitement alternatif réalisable pour l'infection bactérienne chez les patients porteurs d'un stent.

L'état de la culture bactérienne aux États-Unis a été analysé en utilisant la méthode de coloration CV pour estimer l'approximation de la viabilité bactérienne pendant le temps de culture. Chaque jour propose les différentes formations de biofilm, basées sur la Fig. 1a (culture de 0 à 3 jours). La coloration CV a fonctionné comme un colorant intercalant, qui est utilisé pour la visualisation rapide du biofilm, et la coloration a permis la quantification des cellules, comme le montre la Fig. 1b. L'estimation de la formation de biofilm au jour 3 a atteint plus de 80%, par rapport à celle du jour 0.

Croissance du biofilm bactérien : (a) endoprothèses urétrales colorées au cristal violet à différents moments après la culture et (b) viabilité bactérienne par rapport au temps de culture.

Une expérience MTT a été réalisée pour évaluer la viabilité cellulaire dans les paramètres de pré-traitement et de post-traitement pour sélectionner une méthode alternative d'élimination du biofilm bactérien des États-Unis avec une lumière laser de 405 nm. Les cellules traitées ont montré une diminution de la viabilité cellulaire de 2 % (5 min), 4 % (10 min) et 10 % (15 min) après 24 h d'incubation, par rapport au témoin (p < 0,05). Les résultats du test MTT ont démontré que l'irradiation laser de 15 minutes provoquait un effet toxique sur les cellules, entraînant une réduction cellulaire de plus de 10% (Fig. 2a). L'évolution de la température sur la figure 2b montre que le maximum a atteint une température de 32 ° C pour une irradiation de 15 minutes.

Réponse des cellules normales (CCD-986sk) à une irradiation laser à 405 nm : (a) viabilités cellulaires de différents temps d'irradiation (CTRL = contrôle ; (*p < 0,05 vs CTRL ; N = 5) et (b) évolution de la température pendant l'irradiation laser à la surface de la suspension CCD-986sk dans un milieu DMEM.

La coloration CV a été utilisée pour calculer la survie bactérienne avant et après le traitement au laser afin d'évaluer l'impact inhibiteur de la lumière laser à 405 nm sur S. aureus. Comme représenté sur la figure 3a, la viabilité bactérienne a diminué de 26 % en 5 min (p < 0,05), 59 % en 10 min (p < 0,001) et 68 % en 15 min (p < 0,001), respectivement. La température maximale à la surface du stent a atteint 37,5 °C (Fig. 3b).

Inhibition du biofilm bactérien après irradiation laser 405 nm : (a) viabilité bactérienne après exposition à la lumière laser 405 nm à différents temps d'irradiation (CTRL = contrôle ; *p < 0,05 et **p < 0,001 vs CTRL ; N = 5) et (b) évolution de la température pendant l'irradiation laser sur la surface du stent urétral.

La figure 4a montre la détermination de S.aureus en UFC après une irradiation à 405 nm, et chaque condition de traitement représente un nombre différent de colonies (N = 10). Les résultats ont montré que la colonie totale diminuait après l'irradiation et était représentée en log UFC/mL (réduction de 1,2 log, 2,2 log et 3,2 log pendant 5, 10 et 15 min) (Fig. 4b). Bien que l'inhibition maximale ait atteint une réduction de 3,2 log (p < 0,01) en 15 min d'irradiation (270 J/cm2), la viabilité des cellules humaines (CCD-986sk) (Fig. 2a) dans les mêmes conditions a également diminué de plus de 10 %. Ainsi, l'irradiation laser de 10 min pourrait atteindre le taux d'inhibition minimum (réduction de 2 à 3 log) pour empêcher la formation de biofilm aux États-Unis avec la dose de traitement de sécurité.

Inhibition bactérienne de S. aureus après exposition au laser 405 nm à différents temps d'irradiation : (a) cellules bactériennes sur plaques de gélose (CTRL = contrôle) et (b) quantification de l'élimination bactérienne en log UFC/mL (*p < 0,05 et **p < 0,01 vs CTRL ; N = 10).

La figure 5a présente les niveaux de génération de ROS déterminés par la coloration NBT, qui a été introduite dans la membrane cellulaire. Le résultat montre que le NBT pouvait détecter la génération de ROS dans toutes les conditions traitées. Les résultats de la génération de ROS étaient de 21, 7, 46, 7 et 74, 4% (p <0, 05) pendant 5, 10 et 15 min, respectivement. Selon ce résultat, une irradiation plus longue du laser à 405 nm pourrait produire plus de ROS affectant la mort cellulaire. La figure 5b montre le résultat de l'activité de piégeage des antioxydants en utilisant le test DPPH. Les résultats démontrent que les radicaux libres après la production de ROS ont augmenté, sur la base du temps d'irradiation de la lumière laser à 405 nm. Les conditions de traitement (5, 10 et 15 min) ont atteint 22 % (p < 0,05), 43 % (p < 0,001) et 62 % (p < 0,001) d'activité antioxydante par rapport au contrôle, respectivement. Le groupe témoin (pas de traitement au laser) a montré la plus petite capacité antioxydante tandis que les groupes traités ont produit des capacités antioxydantes croissantes avec l'augmentation des doses de lumière. Le groupe bactérien qui a reçu la plus grande dose de 15 min a révélé une augmentation statistiquement significative de l'activité de piégeage du DPPH (p < 0,05) par rapport au témoin. La figure 5c présente la concentration de fuite de protéines avant et après le traitement en utilisant la méthode de Lowry. L'observation de la concentration de fuite de protéines en 5, 10 et 15 min a atteint 37, 71 et 69 µg/mL, respectivement. La plus grande quantité de fuite de protéines après le traitement au laser a été mesurée en 10 min d'irradiation laser et a diminué en 15 min. L'activité de fuite de protéines a atteint un état stationnaire après 10 min de traitement car la concentration en protéines a chuté en 15 min d'irradiation, par rapport à 10 min d'irradiation laser (p = 0,92). Ces découvertes ont suggéré que le laser à 405 nm pourrait favoriser la mort bactérienne en faisant subir aux bactéries un stress oxydatif accru et en permettant aux protéines de s'échapper de la membrane bactérienne endommagée.

Effet d'inhibition optique de la lumière laser de 405 nm contre S. aureus dans le stent urétral : (a) génération de ROS pendant le traitement, (b) activité de piégeage du DPPH et (c) concentration de fuite de protéines à l'aide de la méthode de Lowry (*p < 0,05 et **p < 0,001 par rapport à CTRL ; ns = non significatif ; N = 5) et (d) images SEM de S. aureus après traitement au laser (les flèches bleues, orange et rouges représentent biofilm épais, bactéries libérées du biofilm et mort bactérienne avec dommages morphologiques (barre d'échelle = 2 µm ; 20 kX et barre d'échelle d'entrée = 20 µm ; 2 kX).

La perte d'intégrité membranaire des biofilms bactériens exposés à quatre conditions de traitement différentes est illustrée au SEM (Fig. 5d) et aux images fluorescentes de la Fig. 6 (CTRL, 5, 10 et 15 min). Une proportion significative de colonies bactériennes s'est développée en une architecture de biofilm épais constituée de matériaux polymères extracellulaires (flèche bleue) dans le témoin non traité (Fig. 5d (CTRL)). Selon la Fig. 5d (5 min), la lumière laser à 405 nm a détruit le biofilm et a libéré le biofilm dans une seule cellule (flèche orange). Les colonies bactériennes dans le biofilm déposé aux États-Unis ont montré l'absence de morphologie intacte du biofilm. Sur la figure 5d (10 et 15 min), certaines bactéries ont été endommagées (flèche rouge), indiquant la mort cellulaire, et les bactéries ont été retirées des États-Unis.

Analyse de l'intégrité de la membrane bactérienne après traitement au laser : (a) bactéries vivantes colorées avec SYTO 9, (b) bactéries mortes colorées avec PI, (c) quantification de l'intensité des pixels pour les bactéries vivantes (intensité verte) et (d) quantification de l'intensité des pixels dans les bactéries mortes (intensité rouge) (**p < 0,001 vs CTRL ; ns = non significatif ; N = 7 ; barre d'échelle = 100 µm ; 40X).

L'évaluation des images fluorescentes a indiqué que la mise en œuvre de la lumière laser à 405 nm a considérablement réduit le nombre de cellules bactériennes avec peu de membranes cellulaires intactes restantes. Le SYTO 9 a marqué la membrane intacte restante en tant que bactérie vivante (couleur verte) et la population après le traitement était inférieure à celle du contrôle (Fig. 6a). L'iodure de propidium (PI) a démontré que le nombre de bactéries après le traitement était supérieur à celui du témoin, ce qui signifie plus de lésions membranaires représentées en rouge après le traitement (Fig. 6b). La quantification des bactéries vivantes (Fig. 6c) représentées en intensité verte a confirmé que la lumière laser à 405 nm pouvait inhiber le biofilm bactérien aux États-Unis, ce qui concorde bien avec les résultats des images SEM (62, 21 et 4 % pour 5, 10 et 15 min (p < 0,001), respectivement). La quantification des bactéries mortes a validé que la lumière laser à 405 nm pouvait inhiber les bactéries qui obtenaient une intensité rouge plus élevée après l'exposition au laser à 405 nm (17, 68 et 98 % pendant 5, 10 et 15 min, respectivement) (Fig. 6d).

L'étude actuelle a tenté de comprendre l'effet de la lumière laser à 405 nm contre les États-Unis développés par le biofilm bactérien. Le traitement au laser a été utilisé pour tenter de remplacer ou d'aider l'utilisation d'antibiotiques pour prévenir les effets secondaires. Un autre traitement pour prévenir les infections urinaires est le retrait du stent, mais parallèlement à cela, des traumatismes et d'autres risques, tels que des complications urologiques majeures après le retrait du stent et l'obstruction urétrale, se produisent toujours24,25. Ainsi, le traitement alternatif, tel que l'irradiation au laser, peut être une autre option pour prévenir les infections urinaires.

La lumière laser à 405 nm a la capacité d'inhiber la formation de biofilm bactérien aux États-Unis. Le mécanisme d'inhibition de la formation de biofilm repose sur la génération de ROS, qui peut affecter la désintégration de la membrane et la mort cellulaire26,27. Selon un travail antérieur28, les porphyrines endogènes dans les cellules bactériennes absorbaient sélectivement la lumière laser à 405 nm et produisaient les ROS intracellulaires nécessaires pour tuer efficacement les bactéries. De plus, la présence de ROS peut entraîner une peroxydation des lipides, une oxydation des protéines et des acides nucléiques et une inhibition enzymatique, qui peuvent toutes détruire les micro-organismes21. Giuliano et al. ont rapporté qu'un patient typique sous une procédure urologique avec une culture d'urine positive a 103 colonies29. La réduction bactérienne du présent travail a confirmé que l'inhibition à l'aide de la lumière laser à 405 nm pouvait réduire la réduction de plus de 3 log après 15 min d'exposition au laser avec une irradiance de 0,3 W/cm2. Bien que la condition ait été peu toxique pour les cellules normales (Fig. 2), la dose de sécurité doit encore être confirmée pour ce traitement avant les traductions cliniques. Bauer et al. ont rapporté que les effets cytotoxiques ont été trouvés à 300 J/cm2 après une exposition au laser à 405 nm30. Un test MTT effectué après 15 min d'irradiation laser (270 J/cm2) a également confirmé les effets cytotoxiques avec plus de 10 % de réduction cellulaire. Par conséquent, l'irradiation laser de 10 minutes d'une lumière laser de 405 nm pourrait être la dose sûre (180 J/cm2) avec une réduction cellulaire inférieure à 10 % et une réduction bactérienne de 2,2 log.

La génération de ROS après un traitement au laser à 405 nm a été examinée en utilisant la coloration NBT, qui interagit avec les ions superoxyde pour produire un précipité de formazan violet/bleu intracellulaire insoluble et stable31. La production de ROS est affectée par le temps d'exposition du laser 405 nm aux bactéries. Plus l'exposition à la lumière est longue pour les bactéries, plus il est possible de détecter de ROS dans chaque condition. De plus, l'activité de piégeage affectée par les ROS a été réalisée par dosage DPPH, qui a donné des résultats similaires à la génération de ROS après le traitement au laser. La capacité du laser à 405 nm qui interagit avec les bactéries pour donner de l'hydrogène au DPPH et le convertir en DPPH-H est considérée comme une efficacité de piégeage des radicaux libres. Ce phénomène a entraîné une diminution de la valeur d'absorbance après que la couleur pourpre radicale (DPPH) a été changée en couleur jaune (DPPH-H)32. De plus, l'effet de la lumière laser à 405 nm contre les cellules bactériennes a été confirmé en utilisant l'estimation de la fuite de protéines par la méthode de Lowry. Fait intéressant, la concentration de fuite de protéines après le traitement a augmenté, mais pour une irradiation de 15 minutes, la concentration de protéines au départ a diminué et a entraîné une plus faible quantité de protéines libérées, probablement en raison de la désintégration des molécules de protéines par l'irradiation prolongée au laser. La plus grande quantité de concentration de protéines s'est produite en 10 min avec 71 µg/mL. Étant donné que la protéine est un type de composant intracellulaire essentiel33, la fuite de protéines est considérée comme une indication comprenant à la fois la fuite cytoplasmique, l'endommagement de la couche lipidique34 et des membranes cellulaires35.

L'effet du laser à 405 nm sur les cellules morphologiques dépendait du temps d'irradiation au laser à 405 nm, entraînant l'élimination du biofilm et des dommages cellulaires en 10 et 15 min. La structure passe du cercle parfait au cercle rétréci, causé par la désintégration de la membrane confirmée par les images SEM des bactéries. On pense qu'un critère pour déterminer si les cellules bactériennes sont vivantes ou mortes est l'intégrité cellulaire et membranaire. Les cellules vivantes sont censées avoir les membranes cellulaires intactes et étanches qui sont imperméables à certaines colorations, tandis que les cellules mortes sont supposées avoir des membranes perturbées et/ou endommagées36. La coloration SYTO 9 se lie à l'ADN et à l'ARN et émet une fluorescence verte tandis que le PI ne peut pénétrer que dans les cellules avec la membrane compromise, qui se lie à l'ADN et à l'ARN et émet les signaux de fluorescence rouge37. La perte d'intégrité de la membrane après 10 et 15 min d'irradiation laser avait une intensité de pixel vert plus faible et une intensité de pixel rouge plus élevée par rapport au témoin. Il a été confirmé que le laser à 405 nm provoquait la désintégration de la membrane des bactéries et émettait les signaux de fluorescence rouge des bactéries mortes après le traitement.

Pour les applications cliniques, la méthode proposée devrait être utilisée pour les patients atteints d'infection urinaire en insérant un dispositif optique intégré au panier dans l'urètre et en le positionnant sur les États-Unis. La fibre optique diffusante située dans le canal urétral peut irradier une lumière laser de 405 nm sur la surface de l'US à demeure pour prévenir ou minimiser la formation de biofilm bactérien sur l'US avec des effets photo-inhibiteurs. Des travaux ultérieurs devraient donc tester un modèle in vivo pour explorer les doses cliniques et adapter la dose optimale à un canal urétral et aux tissus périphériques. Le taux d'inhibition minimum pour éliminer 103 colonies pourrait être différent dans la condition en temps réel. Ainsi, il est nécessaire d'effectuer des expériences dans des conditions qui peuvent imiter le canal urétral. En plus d'en faire l'un des traitements des infections urinaires chez les patients porteurs d'un stent, nous devons clarifier et surveiller l'effet photo-inhibiteur contre les maladies urologiques, telles que l'obstruction urétrale et la sténose urétrale. Enfin, une étude pilote devrait être réalisée pour identifier et optimiser les conditions de traitement clinique, telles que la puissance du laser, le temps d'irradiation, le nombre et la durée du traitement, ainsi que pour valider l'efficacité et la sécurité des traductions cliniques.

En conclusion, le présent travail a démontré l'efficacité d'une lumière laser à 405 nm pour l'inhibition bactérienne aux États-Unis avec une réduction bactérienne de 2 à 3 log et la marge de sécurité. La génération de ROS après une exposition au laser de 405 nm au biofilm a contribué à la fuite de protéines, à la désintégration de la membrane et à la mort cellulaire affectée. D'autres études examineront l'inhibition bactérienne simultanée en utilisant le multi-bactérien in vivo pour atténuer le risque d'infection urinaire chez les patients porteurs d'un stent en réduisant la présence de résistance bactérienne causée par l'utilisation prolongée d'antibiotiques.

Les échographies stériles ont été achetées chez UVENTA™ Uretral stent ; TAEWOONG Medical, Corée du Sud. L'US était auto-extensible, d'une longueur de 80 mm et d'un diamètre de 10 mm, et constitué d'une structure métallique implantable à couverture totale en fil de nitinol et recouverte d'une fine couche de silicone (non biodégradable). S. aureus (KCTC 1916) provenant d'une culture mère bactérienne (− 80 °C) ont été placés dans une plaque de gélose et inoculés pendant 24 h. Ensuite, les bactéries ont été sous-cultivées dans un bouillon de soja trypsique (TSB) (50 ml) et incubées pendant 24 h dans un incubateur à 37 ° C. Pour déterminer le nombre de colonies bactériennes, la méthode McFarland38 a été utilisée pour obtenir 108 colonies dans 10 mL. Initialement, du milieu frais a été pompé (P1 = 1,5 mL/min) dans un petit tube en silicone (diamètre intérieur = 4 mm ; diamètre extérieur = 5 mm ; Sungjin, Corée du Sud) avec injection de suspension bactérienne (10 mL). Ensuite, la deuxième pompe (P2 = 50 ml/min) a été allumée lorsque P1 a drainé le support à travers le tube en silicone et a été utilisée pour drainer le support en silicone plus grand (diamètre intérieur = 10 mm ; diamètre extérieur = 12 mm ; Sungjin, Corée du Sud) pendant trois jours. Un US a été placé dans un tube en silicone plus grand et le silicone a été placé dans un bain-marie à 37 ° C. Par la suite, le milieu utilisé s'est écoulé dans une autre bouteille. Des milieux frais ont été pompés toutes les 4 h avec P1 pour empêcher les bactéries de se développer et de former un biofilm uniforme aux États-Unis. Il convient de noter que le processus actuel était axé sur le développement du biofilm bactérien aux États-Unis in vitro, qui ne reproduit guère les conditions cliniques. La figure 7A montre la configuration. Après avoir été cultivé pendant trois jours, les États-Unis ont été colorés avec du cristal violet (CV) pour déterminer si le biofilm s'était formé pendant les jours de culture, comme le montre la figure 7b.

Illustrations schématiques de la préparation bactérienne : (a) culture bactérienne dans un stent urétral dans des conditions dynamiques, (b) exemples de stent urétral avant (jour 0) et après la culture, et (c) traitement au laser à 405 nm mis en place. (jour 3 ; coloré avec du cristal violet ; TSB = bouillon de soja trypsique ; SA = suspension de S. aureus ; WB = bain-marie ; US = stent urétral ; UM = support utilisé ; P1, P2 = pompe, S1 = petit silicone, S2 = gros silicone et DF = fibre diffusante).

Le dispositif optique intégré au panier utilisé dans cette étude a été adapté en modifiant la forme du panier, son diamètre (10 mm) et la caractérisation du matériau utilisé pour le dispositif à panier des travaux antérieurs39. Le panier, qui a été intégré à un diffuseur optique, vise à maintenir la position de la fibre diffusante au centre lorsqu'elle est placée aux États-Unis, de sorte que la diffusion de la lumière puisse être uniforme dans toutes les directions. La lumière bleue (405 nm ; laser CNI, Changchun, République populaire de Chine) a été utilisée comme source de lumière avec une irradiance de 0,3 W/cm2. Les conditions de traitement variaient en fonction des durées d'irradiation de 5, 10 et 15 min. Le contrôle était une condition non traitée. Les fluences correspondantes étaient de 90, 180 et 270 J/cm2. Pour la zone de traitement, nous avons coupé le stent en 10 mm de longueur et exposé la lumière laser de 405 nm à l'intérieur du stent. Une configuration expérimentale a été développée en plaçant les États-Unis cultivés dans un support debout, et un dispositif intégré au panier a ensuite été positionné dans la même direction et inséré dans les États-Unis au centre. Une caméra infrarouge (FLIR A325, 320 × 240 pixels, résolution = 25 μm, plage spectrale = 7,5–13 μm ; FLIR, Wilsonville, Oregon) a été placée à 30 cm au-dessus de la surface des États-Unis et contrôlée avec un ordinateur personnel pour surveiller l'évolution de la température pendant le traitement (Fig. 7c).

Le dosage du bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium (MTT ; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, États-Unis) a été utilisé pour évaluer la sécurité et la toxicité de la lumière laser à 405 nm. La lignée cellulaire CCD-986sk (obtenue auprès de la Korean Cell Line Bank) a été utilisée comme lignée cellulaire normale dans toutes les conditions de traitement. Les cellules CCD-986sk ont été décongelées dans un bain-marie à 37 ° C, placées dans un tube conique de 15 ml, 3 ml de milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM, Corning, NY, USA) ont été ajoutés et la suspension a été centrifugée à 1000 × g pendant 5 min. Le surnageant a été retiré et les cellules ont été placées dans une boîte de culture avec 10 ml de DMEM pendant 48 h. Une sous-culture cellulaire a été effectuée tous les deux ou trois jours pour obtenir une lignée cellulaire stable pour le test MTT. Les lignées cellulaires stables ont été comptées, ensemencées dans des plaques de 24 puits et incubées pendant 24 h pour permettre aux cellules de bien se développer avant le traitement. Les cellules ont été traitées selon les conditions de traitement appliquées aux US (temps d'irradiation : 5, 10 et 15 min) avec une irradiance de 0,3 W/cm2. Les cellules traitées ont été incubées pendant 24 h. Après l'incubation, le milieu a été retiré et une solution de MTT a été ajoutée et incubée pendant 3 h dans l'obscurité à 37 ° C. La solution de MTT a été retirée, remplacée par du diméthylsulfoxyde (DMSO) et incubée pendant 15 min. L'absorbance a été déterminée par spectrophotométrie à 570 nm à l'aide d'un lecteur de microplaques (Multiskan GO, Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA ; N = 10 par condition).

Après le traitement, la coloration CV a été utilisée pour estimer la viabilité bactérienne en lavant les États-Unis avec de l'eau distillée et en incubant pendant 20 minutes dans une solution CV. Ensuite, une solution de solubilisation a été ajoutée (95 % d'éthanol avec 5 % d'eau distillée) et soniquée pendant 10 min. Les solutions bactériennes ont été placées dans une plaque à 96 puits, et son absorbance à 570 nm a été mesurée à l'aide d'un lecteur de microplaques (Multiskan GO, Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA ; N = 10 par condition). De plus, la viabilité bactérienne a été calculée en termes d'unités formant colonies (UFC). Dix millimètres d'US ont été lavés avec 1 ml d'eau distillée et placés dans un tube conique de 15 ml. US a été soniqué pendant 10 min et vortexé pendant 5 min. La suspension bactérienne a ensuite été diluée au 10ème, et 100 μL de la suspension ont été étalés sur une plaque de gélose tryptique soja (TSA) et incubés pendant 24 h à 37 °C. Après incubation, les plaques de gélose ont été analysées à l'aide d'OpenCFU40 pour calculer le nombre de colonies bactériennes, qui est représenté par le nombre logarithmique de la viabilité bactérienne sur la surface US de 10 mm (CFU/mL, N = 10 par condition).

Pour étudier le mécanisme dominant du traitement proposé, les États-Unis témoins et traités ont été placés dans un tube conique de 15 ml avec 1 ml d'eau distillée, soniqués pendant 20 min et vortexés pendant 5 min pour détacher les bactéries aux États-Unis. Une solution de 1 mg de nitro bleu tétrazolium (NBT) a été ajoutée au tube et incubée pendant 30 min dans l'obscurité. Après avoir ajouté du HCl 0,1 M à la solution pour inhiber l'interaction bactérienne avec le NBT, tous les tubes ont été centrifugés à 12 000 × g pendant 5 min. Pour libérer les ROS intercellulaires, les pastilles ont d'abord été traitées avec 800 ml de solution saline et 400 ml de diméthylsulfoxyde (DMSO). Pour estimer la génération de ROS, 200 μL de chaque échantillon ont été placés dans une plaque à 96 puits et mesurés à 575 nm (N = 5 par condition). La génération de ROS collectée a été normalisée par l'absorbance des échantillons de contrôle pour exclure toute erreur expérimentale causée par la procédure de sonication. L'équation suivante a été utilisée pour déterminer le niveau d'amplification ROS intercellulaire (Ri):

où Ac est l'absorbance du contrôle et At est l'absorbance de l'échantillon traité.

Le 1,1-diphényl-2-picrylhydrazyl (DPPH) est un radical libre stable utilisé pour évaluer les capacités générales de piégeage des radicaux de divers antioxydants après la génération de ROS. Les dosages de DPPH ont été effectués en ajoutant la solution de DPPH (40 µg/mL de méthanol) aux cellules témoins et traitées et en incubant pendant 30 min dans l'obscurité. Un spectrophotomètre UV a été utilisé pour détecter l'absorbance à 517 nm, et l'expérience a été répétée cinq fois. Une courbe logarithmique d'inhibition du dosage a été utilisée pour obtenir la valeur IC50 de l'étalon41, qui est la concentration de l'étalon requise pour inhiber 50 % du radical libre DPPH. L'absorbance inférieure du mélange réactionnel a suggéré l'augmentation de l'activité des radicaux libres. L'équation suivante a été utilisée pour calculer le pourcentage de l'effet de piégeage du DPPH (Ds).

où Ac est l'absorbance du contrôle et At est l'absorbance de l'échantillon traité.

La méthode décrite par Lowry et al. (1951) a été utilisé pour évaluer les protéines libérées par les cellules de S. aureus (106 UFC/mL) avant et après le traitement avec une lumière laser de 405 nm pendant 24 h. L'absorbance a été mesurée par spectrophotométrie à 660 nm. La quantité de protéine libérée a été déterminée en extrapolant une équation à partir de la courbe d'étalonnage en utilisant de l'albumine de sérum bovin (BSA), comme décrit précédemment42.

Pour évaluer l'architecture de formation du biofilm, les États-Unis témoins et traités ont été lavés plusieurs fois avec de l'eau distillée et fixés à l'aide de glutaraldéhyde à 2, 5% à pH 7, 5 pendant 4 h à température ambiante (26 ° C). Après incubation, l'US a été lavé avec de l'éthanol à 100 % et laissé sécher à température ambiante. Les États-Unis témoins et traités ont été coupés en petits morceaux (5 mm) et recouverts d'or-palladium pour analyse SEM.

Un kit LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability (Bio Probes, Eugene, OR, USA) a été utilisé pour évaluer les bactéries vivantes et mortes en fonction de l'intégrité de la membrane des stents témoins et traités. La suspension bactérienne de l'échographie témoin et traitée a été centrifugée à 1000 tr/min pendant 5 min pour recueillir le biofilm bactérien attaché au stent. Des colorants SYTO 9 et iodure de propidium (PI) ont ensuite été ajoutés à une concentration de 1: 1 et incubés pendant 15 min. Après incubation, 1 μL de suspension a été ajouté sur une lame de verre et recouvert d'une lamelle sous un microscope à fluorescence. Les bactéries vivantes et mortes sont représentées respectivement en vert et en rouge. Une analyse quantitative des images de fluorescence a été effectuée en utilisant le nombre total d'intensités de pixels verts et rouges et en calculant les valeurs RVB avec l'image J (National Institute of Health, Bethesda, MD, USA).

Les données sont représentées sous forme de moyenne et d'écart type dans quatre conditions : une en tant que contrôle et trois autres conditions de traitement (durées d'irradiation : 5, 10 et 15 min). Chaque condition (contrôle et traitement) a été répétée cinq fois (N = 5). L'analyse des UFC a été effectuée en 10 répétitions pour garantir des données appropriées. Le test U de Mann-Whitney a été utilisé pour évaluer toutes les conditions en comparant les conditions de contrôle et de type. SPSS (SPSS, Chicago, USA) a été utilisé pour l'analyse statistique, et p < 0,05 a été considéré comme statistiquement significatif.

Cet article ne contient aucune étude avec des participants humains réalisée par l'un des auteurs.

Toutes les données pertinentes utilisées pour étayer les conclusions de cette étude sont incluses dans l'article. Des informations et données supplémentaires sont disponibles auprès de l'auteur (LM; [email protected]) sur demande raisonnable.

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Les auteurs tiennent à remercier le Dr Sirajunnisa Abdul Razack, chercheur postdoctoral au centre de technologie biomédicale intégrée marine, The National Key Research Institutes in Universities, Pukyong National University, Busan, Corée pour son guide technique d'analyse dans cette étude.

Ce travail a été soutenu par la subvention de la Fondation nationale de recherche de Corée (NRF) financée par le gouvernement coréen (MSIT) (n° 2021R1A2C2003733) et le programme de recherche scientifique fondamentale par l'intermédiaire de la Fondation nationale de recherche de Corée (NRF) financé par le ministère de l'Éducation (n° 2021R1A6A1A03039211).

Industrie 4.0 Convergence Bionics Engineering, Université nationale de Pukyong, Busan, Corée

Luluil Maknuna, Van Nam Tran et Hyun Wook Kang

Centre de technologie biomédicale intégrée marine intégrée, Instituts nationaux de recherche clés dans les universités, Université nationale de Pukyong, Busan, Corée

Luluil Maknuna et Hyun Wook Kang

Division des soins de santé intelligents, Collège des technologies de l'information et de la convergence, Université nationale de Pukyong, Busan, Corée

Byeong-Il Lee et Hyun Wook Kang

Département de génie biomédical, Université nationale de Pukyong, Busan, 48513, République de Corée

Hyun Wook Kang

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LM, VNT et HWK ont conçu et conçu la recherche. LM et VNT ont mené l'expérience. LM a analysé les données et rédigé le manuscrit. BL a effectué une analyse des données, révisé le manuscrit et soutenu le financement. HWK a supervisé l'étude, révisé le manuscrit et approuvé la version finale. Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit.

Correspondance avec Hyun Wook Kang.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Maknuna, L., Tran, VN, Lee, BI. et coll. Effet inhibiteur de la lumière laser de 405 nm sur le biofilm bactérien dans le stent urétral. Sci Rep 13, 3908 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-30280-0

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Reçu : 28 septembre 2022

Accepté : 20 février 2023

Publié: 08 mars 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-023-30280-0

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