Vers un cytophone portable arc-en-ciel avec des diodes laser pour le diagnostic global des maladies

Rapports scientifiques volume 12, Numéro d'article : 8671 (2022) Citer cet article

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In vivo, Cytophone a démontré sa capacité de diagnostic précoce du cancer, des infections et des troubles cardiovasculaires grâce à la détection photoacoustique des marqueurs de maladies circulantes directement dans la circulation sanguine avec une amélioration sans précédent de 1 000 fois la sensibilité. Néanmoins, un cytophone avec une spécificité et une portabilité plus élevées est nécessaire de toute urgence. Ici, nous introduisons une nouvelle plate-forme Cytophone qui intègre un réseau de diodes laser multispectrales miniatures, un codage temps-couleur et un traitement du signal résolu en temps à grande vitesse. À l'aide de diodes laser bicolores (808 nm/915 nm), nous avons démontré l'identification spectrale des caillots blancs et rouges, des cellules de mélanome et de l'hémozoïne dans les érythrocytes infectés par le paludisme sur un fond sanguin et des artefacts. Les données d'un modèle murin de Plasmodium yoelii et de P. falciparum humain en culture ont été vérifiées in vitro par microscopie confocale photothermique et fluorescente. Avec ces techniques, nous avons détecté des cellules infectées dans les 4 h suivant l'invasion, ce qui rend l'hémozoïne prometteuse comme marqueur spectralement sélectif aux premiers stades de la progression du paludisme. Parallèlement aux résultats de notre application précédente de Cytophone avec des lasers conventionnels pour le diagnostic du mélanome, de la bactériémie, de la drépanocytose, de la thrombose, des accidents vasculaires cérébraux et des formes anormales d'hémoglobine, cette découverte actuelle suggère le potentiel de développement d'un cytophone arc-en-ciel portable avec des diodes laser multispectrales pour l'identification de ces maladies et d'autres.

Des progrès significatifs ont été réalisés dans le diagnostic des maladies à l'aide de lasers avancés1. Parmi les différentes méthodes laser, les techniques photoacoustiques (PA) ont montré des avantages en termes de sensibilité, de non-invasivité et de profondeur de pénétration dans les biotissus jusqu'à 3 à 5 cm2,3,4. Plusieurs dispositifs d'imagerie PA ont démontré des résultats cliniques prometteurs in vivo chez l'homme, notamment dans l'évaluation de l'état de la maladie de Crohn5, le diagnostic du cancer du sein6,7 et la surveillance de l'oxygénation du sang dans les veines jugulaires8. Le diagnostic de ces conditions médicales et de bien d'autres commence souvent par l'examen du sang d'un patient; cependant, les tests sanguins existants sont incapables de fournir un diagnostic précoce car leur sensibilité est limitée par le petit volume de sang prélevé (généralement 5 à 10 mL pour les échantillons veineux et quelques μL pour les échantillons capillaires), qui manque jusqu'à 103 à 104 des cellules anormales ou des biomarqueurs dans l'ensemble du volume sanguin (~ 5 L chez les adultes)9. Cette grande partie de cellules manquées peut entraîner une progression de la maladie trop difficile à traiter, comme des métastases, une septicémie ou un accident vasculaire cérébral formé par des cellules tumorales circulantes (CTC), des bactéries et des caillots, respectivement9,10. En particulier, malgré d'énormes efforts dans le développement de divers tests CTC, ils ne sont pas encore recommandés pour une utilisation clinique en raison de leur faible sensibilité, des données incohérentes et, par conséquent, ont une valeur diagnostique peu claire, en particulier pour le diagnostic précoce de la maladie10,11. De plus, la plupart des techniques d'AP existantes, en particulier l'imagerie PA, sont incapables de détecter des biomarqueurs de maladie circulants et à déplacement rapide avec des vitesses typiques de 5 à 10 cm/s, même s'ils sont présents dans les vaisseaux sous-cutanés, ce qui limite encore leur utilité10.

Ces restrictions peuvent être résolues en évaluant des volumes sanguins plus importants in vivo, en utilisant le principe de la cytométrie en flux in vivo avec des méthodes de détection fluorescentes, photothermiques (PT), Raman et surtout PA et leurs combinaisons11,12,13. Parmi ces méthodes, la cytométrie en flux PA in vivo (PAFC) a démontré sa pertinence clinique pour la détection directe dans la circulation sanguine des bactéries (par exemple, S. aureus et E. coli), des caillots, des cellules falciformes, des exosomes, des différentes formes d'hémoglobine (Hb) (par exemple, oxy-, désoxy- et métha-Hb), des nanoparticules (NP) et des CTC utilisant des substances intrinsèques (par exemple, mélanine, Hb, Hz [hémozoïne], cytochromes, car oténoïdes) ou artificiels (p. ex., NP d'or) agents de contraste PA9,12,14,15,16,17,18,19,20. Dans un essai clinique, PAFC a offert une amélioration de sensibilité sans précédent d'environ 1000 fois par rapport aux méthodes de diagnostic existantes pour détecter les CTC, les caillots et les emboles de caillots CTC chez les patients atteints de mélanome in vivo21. Nous avons également démontré que le PAFC in vivo a le potentiel de détecter des cellules murines infectées par le paludisme circulantes dans un modèle animal à un niveau de parasitémie de 0,0000001 %14,15.

Néanmoins, l'utilisation du PAFC dans les pays à ressources limitées est limitée par la complexité technique, la grande taille et le coût élevé des lasers à impulsions à semi-conducteurs couramment utilisés (par exemple, lampe flash, pompé par diode, Q-switch et à base de fibre)1,12. Ces limitations rendent également extrêmement difficile l'utilisation d'un réseau de lasers avec différentes longueurs d'onde, ce qui faciliterait l'identification spectrale de biomarqueurs avec différents spectres d'absorption, également appelés empreintes spectrales, en particulier pour les NP, l'Hb et Hz22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33. Plus précisément, après notre première application pionnière de diodes laser spectralement accordables dans la spectroscopie PA34, quelques tentatives ont été entreprises pour utiliser des diodes laser pour l'imagerie PA35,36 ; cependant, l'énergie d'impulsion des diodes laser était trop faible (au niveau de quelques microjoules [µJ]) pour fournir une sensibilité suffisante. La durée d'impulsion était également relativement longue (90 à 120 ns) par rapport au temps de transit acoustique à travers la petite cible pour correspondre au confinement acoustique pour la génération à haut rendement de signaux PA14,15. Récemment, des progrès significatifs ont été réalisés dans le développement de diodes laser plus puissantes avec une largeur d'impulsion de 15 à 30 ns et une énergie d'impulsion de 0,1 à 2 mJ en utilisant des tailles de réseau d'émetteurs de 0,1 × 5 mm2 à 40 × 50 mm37. Cependant, peu de progrès ont été réalisés dans l'utilisation de ces lasers avec PAFC. Le but du travail décrit ici est de combler le vide dans ce domaine de recherche en utilisant une plate-forme innovante de cytophone arc-en-ciel (c'est-à-dire multicolore) basée sur PAFC qui intègre un réseau de diodes laser miniatures avec modulation de la lumière spectrale temporelle, détection résolue dans le temps des signaux PA codés par couleur dans le temps de chaque cellule ou biomarqueur à mouvement rapide et traitement du signal à grande vitesse. Par rapport aux sources laser conventionnelles, les avantages des nouvelles diodes laser incluent leur petite taille, l'utilisation de réseaux d'émetteurs compacts avec micro-optique, leur faible coût, leur taux de répétition élevé, l'énergie laser nécessaire et la durée d'impulsion appropriée.

Pour illustrer les performances uniques de notre cytophone arc-en-ciel avec des diodes laser, nous démontrons que notre nouvelle plate-forme a la capacité d'identifier les spectres uniques de plusieurs objets en circulation, y compris les caillots blancs et rouges, les cellules de mélanome mimiques et Hz seuls et dans les globules rouges infectés par le paludisme (RBC) parmi le fond sanguin et d'autres artefacts. En nous appuyant sur nos précédentes études liées au paludisme avec des lasers à l'état solide14,15, nous explorons maintenant le potentiel des diodes laser en tant que nouvelles sources optiques prometteuses pour permettre une spécificité PAFC accrue. Ce travail nous a obligés à surmonter des défis tels qu'une faible énergie d'impulsion, une divergence de rayonnement élevée (en particulier avec les réseaux de diodes laser) et la détection et la filtration à grande vitesse des signaux PA multicolores générés dans des cellules individuelles infectées à déplacement rapide par des impulsions de diode laser avec différentes longueurs d'onde. Nous avons particulièrement concentré notre nouvelle plateforme sur le paludisme, qui reste l'une des maladies infectieuses les plus importantes, avec près de la moitié de la population mondiale à risque, entraînant 241 millions de cas cliniques et 627 000 décès rien qu'en 202022. Plus de 96% des décès surviennent en Afrique, presque tous dus à l'espèce Plasmodium falciparum, bien qu'au moins quatre autres espèces soient responsables d'infections humaines dans le monde. Le paludisme représente un cas d'utilisation potentiellement idéal pour le PAFC, car l'invasion et la croissance du parasite dans les globules rouges sont suivies par la génération de Hz riches en fer, qui peuvent être détectés en exploitant des contrastes de PA analogues à ce qui est détecté dans les CTC de mélanome21 étant donné les similitudes dans les propriétés optiques et géométriques entre la mélanine et Hz14. L'étalon-or pour le diagnostic du paludisme a été la microscopie optique des échantillons de sang, qui permet la spéciation et la quantification des parasites, bien que les nouveaux tests de diagnostic rapide qualitatifs (TDR) aient rapidement dépassé la microscopie dans les milieux endémiques23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33. Malheureusement, les deux diagnostics au point de service ont une sensibilité limitée, avec des limites de détection de 50 à 200 globules rouges infectés par le paludisme (iRBC)/µL, prennent au moins 20 à 30 minutes à effectuer, et les TDR sont de plus en plus entravés par les suppressions d'antigènes cibles. Alors que la réaction en chaîne par polymérase (PCR) conventionnelle et en particulier les méthodes basées sur l'ARN ont amélioré la sensibilité jusqu'à 1 parasite/µL ou mieux, leur utilité dans les environnements de point de service est limitée en raison des exigences de temps, de machines et de consommables, ainsi que d'être sujet aux erreurs, car des traces de contaminant peuvent conduire à un diagnostic erroné23.

L'Organisation mondiale de la santé (OMS) cherche à réduire les décès liés au paludisme d'au moins 90 % dans le monde d'ici 203022, mais actuellement, aucun test de dépistage du paludisme sur le marché n'a un coût raisonnable ou n'est suffisamment sensible pour identifier les individus asymptomatiques, un réservoir qui représente un obstacle critique à l'éradication du paludisme. Notre travail peut répondre à la demande de l'OMS en développant le dispositif portable, non invasif (sans aiguille), sans étiquette (sans agent de contraste) et sûr (sans dommage cutané, douleur ou contamination sanguine) requis. Nous rapportons ici l'utilisation d'une nouvelle plate-forme Cytophone arc-en-ciel (multicolore) avec de petites diodes laser rentables pour une détection rapide (en quelques secondes) et une identification en temps réel des globules rouges infectés par Plasmodium in vitro et dans un modèle murin in vivo avec un potentiel élevé de traduction chez l'homme.

La caractéristique distinctive de la nouvelle plate-forme arc-en-ciel Cytophone (Fig. 1a) est son utilisation d'un réseau de diodes laser multispectrales qui produit des impulsions laser avec différentes longueurs d'onde et le délai pour le codage temps-couleur (Fig. 1b). Pour valider cette plate-forme, nous avons appliqué des impulsions de diode laser à fréquence de répétition d'impulsion élevée (1 à 3 kHz) nanosecondes (15 à 25 ns) à deux longueurs d'onde, 808 nm et 915 nm. L'irradiation laser transcutanée des vaisseaux à travers la peau intacte entraîne une augmentation de la température des agents de contraste PA absorbant la lumière, tels que l'Hb dans les globules rouges normaux (nRBC) et Hz avec une absorption locale plus élevée dans les iRBC que dans l'Hb dans les nRBC dans la région du proche infrarouge (NIR) (Fig. 1c). La dilatation thermique rapide des zones chauffées conduit à la génération thermoacoustique d'ondes acoustiques appelées signaux PA qui sont détectées avec un petit transducteur à ultrasons (US) (quelques mm de diamètre) (Fig. 1a).

Plateforme de diagnostic in vivo du cytophone arc-en-ciel. (a) Le principe du cytophone bicolore; les encarts montrent un schéma de la structure iRBC (en haut, à gauche) et une image photothermique (PT) d'un iRBC réel (en bas, à droite) avec des pics Hz. (Adobe Fireworks CS5, www.adobe.com) (b). Codage temps-couleur de deux impulsions laser à taux de répétition élevé avec différentes longueurs d'onde de λ1 et λ2—(en haut)—pour l'identification spectrale des iRBC (au milieu) en arrière-plan des faux signaux synchronisés (par exemple, de la peau pigmentée) et non synchronisés (en bas). ( c ) Spectres d'absorption de la mélanine, des nRBC, du Hz, du vert d'indocyanine (ICG) et des billes magnétiques 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21. ( d ) Traces PA avec contraste PA positif et négatif sur un fond sanguin créé par de nombreux nRBC et caillots sanguins circulants (CBC).

Les signaux PA de l'Hb dans les nRBC dans le volume de détection créent une ligne de base de trace (Fig. 1d). Lorsque les iRBC avec une absorption optique locale liée à Hz plus élevée au-dessus du fond Hb des nRBC passent le volume de détection (c'est-à-dire irradié), l'absorption correspondante augmente, générant des pics de PA transitoires positifs nets sur le fond sanguin. À titre de comparaison, les caillots sanguins circulants blancs et rouges (CBC) produisent des pics PA négatifs et positifs (Fig. 1d).

Sur la base des caractéristiques distinctives des spectres d'absorption de Hz dans les iRBC et de Hb dans les nRBC, en particulier leur absorption différentielle dans la fenêtre spectrale de 770 à 930 nm, nous avons sélectionné le mode bicolore pour démontrer la capacité de Cytophone à identifier spectralement les iRBC avec deux impulsions laser à 808 et 915 nm et un court délai électronique τE (10 μs) pour le codage temps-couleur (Fig. 1b, en haut). Ces impulsions avec un taux de répétition de 3 kHz interagissent avec les mêmes cellules individuelles à déplacement rapide, ce qui génère des signaux PA codés en couleur temporelle à partir des mêmes cellules lorsqu'elles passent le volume de détection (Fig. 1a). Plus précisément, les iRBC produisent des signaux PA avec des amplitudes plus élevées à 808 nm qu'à 915 nm (Fig. 1b, milieu), tandis que les nRBC génèrent des signaux PA avec des amplitudes plus élevées à 915 nm qu'à 808 nm comme pour les CBC rouges (Fig. 1b, bas, droite). La combinaison du codage d'impulsion laser temps-couleur avec la détection de signal PA résolue dans le temps permet également l'identification d'une paire de vrais signaux PA synchronisés d'iRBC dans le vaisseau venant au transducteur (Fig. 1a) avec un retard acoustique bien résolu τA (≥ 0,2 µs) par rapport aux signaux de fond synchronisés appariés de la couche de peau pigmentée (Fig. 1b, en bas, à gauche) ainsi que non synchronisés avec les impulsions laser des faux signaux (Fig. 1b, en bas, au centre) d'origines différentes (par exemple, des vibrations, de l'acoustique de l'environnement et des interférences électromagnétiques).

Dans le Cytophone, après un système dit de collimation à axe rapide (FAC) (Fig. 2a, b) utilisant un réseau de microlentilles, les faisceaux de deux diodes laser sont mélangés dans le sens coaxial avec un miroir dichroïque (Fig. 2a). L'optique de focalisation, constituée d'une lentille sphérique et cylindrique, forme un faisceau linéaire d'une largeur d'environ 80 µm et d'une longueur de 1 mm. Les deux réseaux d'émetteurs compacts (Fig. 2b) fournissent deux impulsions de longueur d'onde (Fig. 2c) avec une énergie de 110 à 130 µJ. La diffusion de la lumière dans les biotissus entraîne un flou du faisceau laser qui diminue considérablement la résolution optique (Fig. 1a). Pour fournir une résolution spatiale plus élevée, nous avons appliqué le schéma Cytophone à résolution acoustique en utilisant le transducteur US cylindrique focalisé avec une résolution latérale de 65 ± 9 µm. La configuration du transducteur cylindrique nous permet de minimiser le volume de détection et, par conséquent, le fond sanguin des nRBC, maximisant ainsi le rapport signal sur bruit (SNR) des iRBC tout en évaluant simultanément tous les iRBC dans l'ensemble de la section transversale du vaisseau sanguin. Pour collecter les signaux PA avec les formes d'onde bipolaires typiques (Fig. 1b, milieu), la plate-forme a été équipée d'une carte de conversion analogique-numérique. Les formes d'onde du signal PA ont été moyennées de 4 à 16 fois pour augmenter le SNR, puis transformées en traces de manière analogue à la cytométrie en flux conventionnelle12 (Fig. 1d). En conséquence, Cytophone génère des pics de trace avec des contrastes positifs et négatifs sur un fond sanguin (Fig. 1d). Les caractéristiques (par exemple, l'amplitude et la largeur) de chaque pic au-dessus du niveau de fond établi ont ensuite été analysées à l'aide d'un logiciel personnalisé basé sur MATLAB.

Configuration de cytophone bicolore in vivo avec deux diodes laser. (a) Schéma optique. (Adobe Fireworks CS5, www.adobe.com) (b) Photo de deux modules de diode laser à deux longueurs d'onde. ( c ) Spectres d'émission de diode laser avec des longueurs d'onde centrales de 808 et 915 nm. ( d ) Images au microscope PA d'un fragment d'oreille de souris à 532 nm (en haut) et 820 nm (en bas). FAC = système de collimation à axe rapide ; ADC = convertisseur analogique-numérique.

Pour déterminer si la plate-forme Cytophone à résolution acoustique avec des diodes laser avancées peut fournir à la fois une valeur diagnostique et une spécificité spectrale élevée, nous avons comparé ses performances in vivo et in vitro au PAFC conventionnel, qui utilise des lasers solides à des longueurs d'onde de 532, 671, 820 et 1 064 nm. Pour ce faire, nous avons utilisé nos fantômes de vaisseaux avancés38,39 et des agents de contraste PAFC liés à la maladie, y compris des billes magnétiques imitant les CTC de mélanome38. Les agents ont été administrés par voie intraveineuse ou péritonéale dans le corps de la souris, suivis d'une détection de PA dans des vaisseaux auriculaires de 40 à 60 µm de diamètre (Fig. 2d). Le contraste PA des vaisseaux sanguins à 820 nm était inférieur à celui à 532 nm (~ 20 fois), ce qui est en corrélation avec le spectre d'absorption de l'Hb (Fig. 1c). Cette signature spectrale augmente le contraste PA des iRBC au-dessus du fond sanguin car l'absorption Hz dans les iRBC n'a que légèrement diminué.

Le Cytophone bicolore avec des diodes laser à deux longueurs d'onde a été initialement validé in vitro par l'identification spectrale des agents de contraste PAFC traditionnels dans des conditions dynamiques à l'aide de notre fantôme de vaisseau sanguin dynamique avec des cellules sanguines à mouvement rapide, des CTC et des fantômes de caillot dans des conditions de flux bien contrôlables38,39. Ce fantôme était composé de plastisol de polychlorure de vinyle avec des nanoparticules de TiO2 modélisant un biotissu aux propriétés de diffusion-absorption médicalement adéquates, une couche superficielle de mélanine imitant la peau pigmentée, des tubes en plastique de différents diamètres et profondeurs imitant les vaisseaux sanguins et une pompe pour déplacer les fantômes cellulaires et les vraies cellules avec des vitesses de 0,5 à 5 cm/s. Pour imiter les cellules fluides et les artefacts pouvant produire de faux signaux, nous avons testé (1) des billes magnétiques de 8 µm avec une absorption dans la plage NIR, similaire à celle des cellules de mélanome (Fig. 1c) ; (2) des agrégats de RBC dans le sang humain imitant les CBC rouges ; 3) billes de silice optiquement transparentes de 100 µm sous forme de fantômes CBC blancs ; (4) colorant vert d'indocyanine (ICG) pour fournir un arrière-plan d'absorption en vrac avec des agrégats d'ICG sous forme de fantômes CBC rouges; et (5) Hz disponible dans le commerce.

Dans notre étude initiale, nous avons utilisé un colorant ICG avec un spectre d'absorption bien caractérisé à une longueur d'onde maximale proche de 808 nm (Fig. 1c) pour estimer les performances du cytophone bicolore. En utilisant la microscopie à fond clair conventionnelle, nous avons identifié la présence de petits agrégats d'ICG dans une solution relativement homogène (Fig. 3a, à droite). L'absorption locale plus élevée des agrégats d'ICG au-dessus de la solution de fond d'absorption d'ICG a conduit à la génération de pics de PA positifs nets au-dessus de la ligne de base dans le flux avec une vitesse de 1 cm/s dans un fantôme de vaisseau de 1 mm de diamètre (Fig. 3a, à gauche). Ces pics apparaissent préférentiellement à 808 nm car l'absorption optique de l'ICG à 915 nm (deuxième couleur utilisée) est environ 9 fois plus faible qu'à 808 nm (Fig. 1c).

Validation des performances du cytophone bicolore (808 nm/915 nm) grâce à l'identification spectrale de cibles PA conventionnelles avec des contrastes positifs et négatifs in vitro à l'aide du fantôme de vaisseau dynamique. ( a ) PA trace avec les pics de contraste positifs des agrégats rares de vert d'indocyanine (ICG) dans une solution ICG relativement homogène (à gauche) et une image en champ clair de l'agrégat ICG (à droite). ( b ) Traces de PA à deux couleurs provenant d'agrégats de RBC dans le sang avec un artefact "une couleur" (à gauche) et une image en fond clair de l'agrégat de RBC (à droite). ( c ) Pics PA à contraste négatif provenant de billes de silice sous forme de fantômes blancs de caillot sanguin circulant (CBC) (à gauche) et image en champ clair d'une seule perle (à droite). ( d ) Pics PA à contraste positif et négatif à partir de CBC rouges et blancs dans le sang (à gauche) et image en fond clair de CBC mixtes rouge-blanc dans le sang (à droite). ( e ) Signaux PA à contraste positif bicolore provenant de billes magnétiques de 23 µm en arrière-plan de nombreuses billes magnétiques de 8 µm. ( f ) Pics de PA positifs bicolores de synthétique ~ 200 µm Hz.

Ensuite, nous avons obtenu des pics PA bicolores (Fig. 3b, à gauche) à partir d'agrégats de RBC dans le sang (Fig. 3b, à droite). Les amplitudes de pic PA à 808 nm et 915 nm sont compatibles avec le spectre d'absorption RBC (Fig. 1c). Nous avons également observé un seul pic à 808 nm, qui est associé à un agrégat d'ICG ajouté. Ces données suggèrent qu'un cytophone bicolore a le potentiel d'identifier une cible sélectionnée (c'est-à-dire des CBC rouges) en présence d'autres artefacts basés sur des empreintes digitales spécifiques.

Pour évaluer plus en détail les performances du cytophone bicolore, nous avons estimé sa capacité à identifier les CBC blancs qui fournissent des pics de contraste négatifs en raison d'une absorbance plus faible que les arrière-plans liés au nRBC (Fig. 1d). Une suspension a été créée en ajoutant 30 mg de billes de silice de 100 µm de diamètre (Fig. 3c, à droite) à 1,5 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS), et la suspension a été secouée toutes les 15 minutes pour empêcher la sédimentation et l'agrégation des microparticules. Nous avons ensuite ajouté une solution d'ICG pour modéliser un fond sanguin. Nous avons observé des pics PA bicolores (808 nm / 915 nm), étroits et à contraste négatif associés à la chute soudaine de l'absorbance dans le volume de détection lorsque des billes de silice transparentes individuelles passaient à travers la zone du faisceau laser (Fig. 3c, à gauche). Des CBC rouges et blancs mélangés dans le sang humain (Fig. 3d, à droite) ont créé des pics PA de contraste positifs et négatifs à 915 nm (Fig. 3d, à gauche). Dans le passé, nous avons utilisé des lasers solides nanosecondes pour obtenir des contrastes PA négatifs comparables en utilisant des paramètres CBC similaires. La similitude de ces résultats indique la possibilité de remplacer les lasers solides par des diodes laser pour la même application.

Ensuite, nous avons utilisé des billes magnétiques relativement rares de 23 µm en arrière-plan de nombreuses billes magnétiques de 8 µm (40 µL de billes à 1 % dans 3 960 µL de PBS), pour servir de substituts des fantômes CTC et nRBC38, respectivement. Nous avons observé de nombreux pics positifs étroits transitoires bicolores (808 nm / 915 nm) provenant des billes magnétiques individuelles relativement grandes au-dessus du "fond sanguin" modélisé par de petites billes (Fig. 3e). Les amplitudes des pics PA (rouge, 808 nm ; bleu, 915 nm) correspondent au spectre d'absorption des microparticules magnétiques (Fig. 1c). Ces données sont très similaires dans les SNR de l'ordre de 5 à 12 mesurés précédemment avec un laser à 1 064 nm dans des conditions similaires38. Encore une fois, cette sensibilité comparable indique la possibilité d'utiliser les diodes laser dans une application similaire.

Enfin, pour vérifier le potentiel des diodes laser à détecter le Hz associé au paludisme, nous avons tenté une détection in vitro du Hz disponible dans le commerce, dont les spectres d'absorption optique et la morphologie (taille et forme) (Fig. S1) sont similaires au Hz natif30,31,32,33. Nos résultats démontrent que Cytophone peut mieux détecter Hz avec des amplitudes de signal PA à 808 nm qu'à 915 nm (Fig. 3f), ce qui est en corrélation avec le spectre d'absorption Hz (Fig. 1c).

En conclusion, en utilisant des conditions de flux in vitro, nous démontrons que la plate-forme Cytophone avec des diodes laser a le potentiel de détecter et d'identifier de multiples cibles (par exemple, des agrégats ICG, des billes magnétiques, des CBC blancs et rouges et Hz).

Après une vérification complète in vitro avec des agents de contraste bien établis pour les techniques d'AP, nous avons testé les performances du cytophone in vivo en surveillant les signaux d'AP des microvaisseaux de l'oreille chez les souris témoins et infectées (Fig. 2d). Les données recueillies auprès de la première cohorte de 5 souris saines ont été utilisées pour optimiser davantage les paramètres. La sonde PA, qui se compose d'une pointe de focalisation optique et d'un transducteur focalisé US, a été positionnée sur la peau de l'oreille au-dessus de la veine sélectionnée et le gel US standard a fourni un couplage acoustique. La navigation du volume focal du transducteur sur la veine examinée a été contrôlée avec précision par imagerie optique et surveillance des signaux PA lorsque la sonde PA a balayé dans différentes directions (Fig. S2). Les amplitudes du signal PA des veines sélectionnées étaient 1,65 ± 0,32 (SD) fois plus élevées que les signaux de fond de la peau. Les signaux PA avec des largeurs typiques de 0, 06 à 0, 1 µs (Fig. 4a) provenaient des vaisseaux d'une profondeur typique de 200 à 250 µm vers le transducteur avec un retard acoustique bien distinct (0, 15 à 0, 3 µs). Cela nous a permis d'éliminer facilement l'influence des signaux de fond PA de la peau sur la sensibilité du cytophone par la détection PA résolue dans le temps des signaux provenant d'objets en circulation uniquement. En conséquence, aucun signal PA positif transitoire au-dessus du fond sanguin établi à deux longueurs d'onde n'a été observé chez les souris témoins (Fig. 4b). La fluctuation de faible amplitude du fond sanguin (ligne de base), généralement de 3 % à 5 %, dépend de la fluctuation de l'énergie laser, du bruit électrique et acoustique, des vibrations, du mouvement physiologique et de la légère fluctuation du nombre de nRBC dans le volume de détection. Le nombre de nRBC est plus important dans les petits vaisseaux (10–15 µm).

Surveillance in vivo de traces de PA bicolores (808 nm / 915 nm) chez des souris témoins et infectées par le paludisme avec des parasites P. yoelii GFP+. ( a ) Détection résolue dans le temps de la forme d'onde du signal PA chez une souris témoin à partir d'un vaisseau auditif par rapport à la peau. ( b ) Traces de PA in vivo d'une souris saine (témoin). ( c ) Traces de PA in vivo d'une souris non infectée avec des agrégats de RBC. Traces de PA in vivo d'une souris infectée à 13 (d), 16 (e) et 21 (f) jours après l'infection. ( g ) Vérification in vivo des données de cytophone à base de diode laser en testant la même souris infectée à l'aide de la plate-forme PAFFC intégrant le module PAFC (trace inférieure) et le module de cytométrie en flux fluorescent (FFC) (trace supérieure). ( h ) Dépendance in vivo des taux d'AP (nombre de signaux d'AP par minute) sur le temps après l'infection.

Nous avons ensuite testé la capacité du cytophone à détecter les agrégats de RBC (c'est-à-dire les CBC rouges riches en Hb) in vivo. En utilisant des procédures bien établies12,21,46 et à basse température, nous avons créé des agrégats de RBC qui ont été identifiés avec l'imagerie optique à haute vitesse46. Les agrégats se déplaçant à travers le volume de détection (irradié) ont créé des pics PA positifs transitoires simultanément dans des canaux bicolores (Fig. 4c). Les amplitudes à la même énergie laser étaient un peu plus élevées (15 à 20 %) à 915 nm qu'à 808 nm, conformément aux spectres d'absorption sanguine (Fig. 1c).

Ensuite, P. yoelii exprimant la GFP a été injecté par voie intrapéritonéale aux souris14. La parasitémie a été évaluée en surveillant quotidiennement les amplitudes et les taux de signal PA (nombre de signaux PA par unité de temps) pendant environ un mois (voir exemples sélectionnés sur les Fig. 4d – f). Pour vérifier les données obtenues avec des diodes laser, nous avons testé les mêmes souris avec notre système intégré PAFC et de cytométrie en flux de fluorescence (FFC) plus établi (appelé PAFFC)14 en utilisant un laser solide pulsé à une longueur d'onde de 671 nm pour générer des signaux PA ainsi qu'un laser à onde continue (CW) à 488 nm pour exciter l'émission chez les parasites exprimant la GFP. La capacité PAFFC multimodale nous a permis d'identifier les iRBC grâce à la coïncidence temporelle des signaux FL et PA provenant de parasites contenant à la fois GFP et Hz à l'intérieur des iRBC, respectivement (Fig. 4g). La présence d'un pic PA uniquement (c'est-à-dire pas de pics liés à FL) indiquait que le Hz était seul dans le plasma sanguin ou englouti dans les globules blancs (par exemple, les neutrophiles)14,26.

En général, PAFFC a confirmé les données du cytophone indiquant la présence d'iRBC chez les mêmes souris infectées. La surveillance des signaux PA pendant un mois chez des souris infectées a révélé la tendance suivante au cours de la progression du paludisme : (1) augmentation progressive du taux de signal pendant les 15 premiers (nous avons commencé le jour 13) à 16 jours ; 2) atteignant un maximum à 15 à 17 jours ; et (3) un déclin éventuel jusqu'à la disparition complète de 28 à 30 jours (Fig. 4h), ce qui est conforme à notre étude précédente14,15. Ce schéma est bien décrit et est lié à la clairance à médiation immunitaire dans le modèle murin14. Les données obtenues avec les diodes laser sont conformes aux données obtenues avec les lasers solides14,18, avec quelques caractéristiques légèrement différentes selon l'emplacement du vaisseau, le débit et la réponse immunitaire.

La surveillance in vivo de l'AP des Hz artificiels, des NP magnétiques et des cellules de mélanome B16F10 injectées dans une veine caudale a révélé que les NP magnétiques et les cellules de mélanome (Fig. S3) étaient éliminées relativement rapidement (20 min à quelques heures), ce qui est cohérent avec nos résultats précédents9,12. Pendant le balayage de la sonde PA le long des vaisseaux, nous avons observé des signaux PA stationnaires avec une distribution spatiale aléatoire. Ces signaux étaient relativement stables en amplitude et se distinguaient bien des pics de PA transitoires aigus (c'est-à-dire de courte durée) produits par les iRBC à déplacement rapide. Cette découverte suggère la présence possible d'iRBC séquestrés (c'est-à-dire, adhérant aux parois des vaisseaux). Il convient de noter que la séquestration des iRBC dans les vaisseaux endothéliaux et d'autres tissus est un phénomène bien décrit dans le paludisme23,25.

Ensuite, nous avons analysé des échantillons ex vivo de souris infectées par Plasmodium avec les mêmes diodes Cytophone/laser et plates-formes PAFFC/laser solide en utilisant notre fantôme de vaisseau sanguin dynamique avec des échantillons de sang en circulation38,39. Aucun signal supérieur aux niveaux de bruit établis n'a été observé dans les échantillons de sang provenant des échantillons de sang de contrôle (c'est-à-dire des souris non infectées), que ce soit avec le cytophone bicolore (Fig. 5a) ou le PAFFC multimodal (Fig. 5c). En revanche, les signaux PA liés à Hz et les signaux FL associés à la GFP des iRBC avec P. yoelii exprimant la GFP ont été observés avec un taux similaire au même stade d'infection que celui observé avec des données in vivo appariées. Plus précisément, la coïncidence temporelle des pics PA bicolores (Fig. 5b) était en corrélation avec les spectres d'absorption de Hz (Fig. 1c), indiquant clairement l'origine liée à Hz des signaux PA. De plus, la coïncidence temporelle des signaux PA et FL (Fig. 5d) confirme cette conclusion, considérant que Hz devrait être situé dans les P. yoelii-iRBC exprimant la GFP. Des amplitudes de signal PA associées à Hz suffisantes pour l'identification ont été induites par des diodes laser au-dessus du bruit de fond (Fig. 5b) et étaient comparables à celles induites par des lasers solides (Fig. 5d). Cela valide la capacité de Cytophone à détecter les Plasmodium-iRBC. De plus, le SNR des canaux PA était généralement plus élevé que celui des canaux FL, ce qui indique l'avantage de Cytophone en tant que plate-forme de diagnostic par rapport aux modules FFC. De plus, le FFC nécessite l'étiquetage des iRBC in vivo, ce qui n'est pas facile, et la plupart des étiquettes FL sont toxiques pour l'homme.

Vérification ex vivo des données de cytotophone in vivo à l'aide du fantôme de vaisseau sanguin. Trace PA bicolore de (a) témoin (souris non infectée) et (b) sang de souris infecté par GFP + P. yoelii 13 jours après l'infection à l'aide de Cytophone avec deux diodes laser à 808 nm et 915 nm. ( c ) Traces fluorescentes et PA du sang de contrôle à l'aide de la plate-forme PAFFC (intégrant des modules PAFC et FFC) avec des lasers à impulsions à 671 nm et des lasers à onde continue à 488 nm pour la génération de signaux PA et fluorescents (FL). ( d ) Fluorescent ex vivo et trace de PA à partir de sang de souris infecté par GFP + P. yoelii au jour 13 à l'aide de la plate-forme PAFFC. Des traces de PA bicolores ont été obtenues avec une plate-forme Cytophone bicolore utilisant des lasers à 671 nm et 820 nm à partir de (e) sang humain témoin et (f) P. falciparum-iRBC de culture in vitro. ( g ) Fragment de trace, démontrant la coïncidence temporelle des pics de PA à différentes longueurs d'onde du même iRBC.

Pour vérifier les données PA, nous avons également appliqué la microscopie photothermique confocale (PTM)40,41,42,43,44,45, une technique que nous avons développée, qui a des principes physiques très similaires aux techniques PA (c'est-à-dire la transformation de l'énergie lumineuse absorbée en chaleur) mais avec une résolution d'imagerie in vitro améliorée40,41,45. Alors que Cytophone détecte les ondes PA en raison de la dilatation thermique des zones chauffées, en PTM, les effets thermiques sont détectés par défocalisation du faisceau sonde en raison des changements de l'indice de réfraction sensible à la température40,41,42,43,44,45. Les avantages du PTM in vitro, par rapport à d'autres techniques optiques, sont sa sensibilité et sa résolution spatiale améliorées, ce qui nous permet de vérifier la capacité du cytophone à identifier des nanocristaux Hz uniques par leur visualisation basée sur le PTM seul ou dans les cellules. Comme mentionné, nous avons utilisé le Hz disponible dans le commerce avec des propriétés similaires au Hz naturel30,31,32,33. Les instruments TEM, STEM et EDS (Fig. 6a – c; Supplémentaire Fig. 1Sa – d) ont démontré une grande hétérogénéité dans la taille et la forme en Hz, commençant au cours du processus de nucléation initial sous forme de nanocristaux cubiques sphériques non idéaux avec une taille minimale de 60 à 80 nm et se transformant en structures allongées avec un rapport de taille (côté long à court) de 2: 1, et principalement 3: 1 avec une longueur maximale allant jusqu'à 1 mm. Au cours de leur croissance, les nanocristaux uniques peuvent former une chaîne de nanocristaux individuels ("cluster linéaire"). À forte concentration, Hz est fréquemment agrégé, avec une taille de cluster Hz moyenne comprise entre 250 et 500 nm avec une médiane de 320 nm. Contrairement au TEM et au STEM, le PTM ne nécessite généralement pas de préparation très spécifique et chronophage (quelques minutes seulement). Avec un objectif 40 ×, les images PTM de Hz ont montré des résultats similaires, y compris une certaine hétérogénéité (Fig. 6e-g) avec une distribution de taille assez symétrique autour d'une valeur médiane de 330 nm (Fig. 6i). Après désintégration par ultrasons des amas Hz, PTM avec une lentille d'objectif 100 × a pu distinguer des nanocristaux Hz individuels avec une résolution limitée par la diffraction à un niveau de 220 nm (Fig. 6f). Ces nanocristaux ont fourni des signaux PA bien détectables (par exemple, Figs. 3f et S3a) avec des amplitudes comparables ou supérieures aux nanoparticules de mélanine dans les cellules de mélanome (Fig. S3b, c). Étant donné que l'utilisation des techniques d'AP et de PT pour étudier le mélanome est bien établie21, ces techniques peuvent être facilement adoptées pour la détection du paludisme avec des diodes laser qui peuvent remplacer les sources laser traditionnelles.

Caractérisation de l'hémozoïne (Hz) utilisée seule pour la calibration des systèmes Cytophone et PTM. ( a ) Image STEM des clusters Hz. Images TEM d'un Hz unique (b) et groupé (c). ( d ) Spectre d'absorption de Hz synthétique. Absorbance spectrale de Hz et pour comparaison microparticules magnétiques d'un diamètre de 5,5 µm. Images en transmission/champ clair (e) & (g) et photothermiques (f) & (h) de petits Hz individuels à faible concertation (5 µg/mL) après traitement par ultrasons (24 kHz, 5 min) et Hz groupés à haute concertation (25 µg/mL). (i) Histogramme de distribution de taille de cristal Hz obtenu avec la microscopie photothermique (PTM); les barres d'erreur présentent l'écart type, n = 55.

Après caractérisation PA et PT du Hz synthétique, nous avons prélevé des échantillons de sang de souris C57BL/6 infectées par voie intrapéritonéale avec un P. yoelii 17XNL exprimant la GFP. Des techniques de transmission (champ clair), de fluorescence et de PTM ont été appliquées pour imager les cellules individuelles dans des échantillons de sang colorés à l'iodure de propidium (PI) pour le ciblage sélectif des parasites à différents stades de développement, des anneaux précoces aux schizontes matures (Fig. 7). Alors que les images de transmission fournissaient peu ou pas d'informations structurelles sur les parasites et Hz à l'intérieur des iRBC, les plates-formes confocales fluorescentes (FL) et PTM en combinaison distinguaient clairement les parasites marqués PI et Hz, respectivement, parmi les fonds d'absorption autofluorescents et associés à l'Hb dans les globules rouges. Plus précisément, la microscopie confocale intégrée PTM et confocale FL a montré une co-localisation Hz et parasite dans les globules rouges de souris infectés par P. yoelii avec une bonne résolution et un contraste d'imagerie élevé. PTM a permis la visualisation de la distribution intracellulaire de Hz et de leurs agrégats (Fig. 7b, c; Fig. S4c – e), qui ne sont pas visibles avec la microscopie à transmission conventionnelle (Fig. 7a). Dans les 2 à 4 h suivant l'invasion, la forme des globules rouges a été transformée du disque biconcave traditionnel en une forme sphérique plus petite. Au stade trophozoïte, les parasites consommaient presque complètement le contenu en Hb, entraînant la formation de plusieurs cristaux de Hz, qui étaient visibles dans les globules rouges avec un fond d'Hb réduit, voire nul, par rapport aux nRBC (Fig. 7c, Fig. S4c). Seul PTM a pu surveiller les détails intercellulaires de la progression du parasite depuis les stades initiaux de l'anneau (Fig. 7a, b) jusqu'au stade schizonte accompagnés de la libération de Hz des globules rouges dans le plasma (Fig. S4f). Dans certains échantillons de sang, nous avons pu observer des globules blancs avec Hz ingéré (Fig. 7d) par rapport au témoin sans Hz (Fig. S4a).

Les images optiques de contrôle et infectées par des cellules de P. yoelii colorées à l'iodure de propidium (PI). Colonne : transmission (première), fluorescence (seconde), microscopie photothermique (PTM) (troisième) et images intégrées (quatrième) de cellules sanguines de souris. ( a ) Stade précoce de l'anneau (2 à 4 h après l'infection) avec un seul parasite dans les globules rouges sans encore aucun signe de Hz. ( b ) Stade trophozoïte (6 à 10 h après l'infection) avec un seul parasite dans les globules rouges avec un ou quelques Hz. ( c ) Stade de schizonte mature (24 h après l'infection) avec de nombreux parasites et Hz. ( d ) Hz dans WBC sans signes de parasites et Hz dans les globules rouges (24 h après l'infection).

Nos études sur le paludisme murin, à la fois in vivo et ex vivo, ont démontré avec succès la capacité de la nouvelle plate-forme arc-en-ciel à détecter et à résoudre le Hz dérivé de Plasmodium dans les globules rouges, nous avons donc ensuite testé le cytophone arc-en-ciel sur l'agent pathogène humain, P. falciparum. Des échantillons congelés de la souche 3D7 de P. falciparum ont été décongelés à l'aide d'une procédure établie en plusieurs étapes (voir Méthodes)23,24,25,26. Les cultures de parasites ont été synchronisées avec une solution de sorbitol à 5 ​​% pour inclure uniquement les parasites au stade anneau post-infection de 0 à 12 h. Neuf échantillons au total ont été prélevés sur les cultures synchronisées, y compris les points de temps suivants après l'infection des érythrocytes : 0–4 h, 6–10 h, 12–16 h, 18–22 h, 24–28 h, 30–34 h, 36–40 h, 42–46 h et 48–52 h.

Aucun signal n'a été observé dans les échantillons de sang de contrôle non infectés (Fig. 5e). En utilisant des parasites cultivés in vitro, le Hz induit par P. falciparum dans les globules rouges i (Fig. 5f, g) a généré des signaux PA plus importants que les globules rouges infectés par P. yoelii ex vivo (Fig. 5b, d), indiquant le potentiel clinique prometteur de Cytophone pour le diagnostic du paludisme. Ainsi, les données indiquent que le remplacement des lasers solides par des diodes laser multicolores plus économiques et plus petites convient à la détection des parasites du paludisme.

Pour étudier l'apparition de parasites P. falciparum à différents stades du cycle de vie érythrocytaire, nous avons de nouveau utilisé des techniques de transmission (champ clair), de fluorescence et de PTM à des cellules individuelles dans des échantillons de culture dans du sang coloré avec du PI (Fig. S5). Les images ont été obtenues avant l'invasion des globules rouges (a), peu après l'invasion (dans les 4 h) avec la formation de Hz simples et groupés (b, c), des stades mûrs (24 h après l'infection) avec plusieurs parasites probablement des schizontes et Hz (d), et un cas unique d'un parasite libéré avec Hz à l'intérieur (e). Il convient de souligner que nous avons pu identifier les événements de formation Hz aux premiers stades de l'invasion (dans les 4 h). Les données PTM peuvent également être présentées en simulation 3D (Fig. S6) ainsi qu'en vidéo avec rotation 3D (Vidéo supplémentaire), ce qui permet une localisation spatiale plus précise de Hz avec un PTM haute résolution. Les données PT étaient bien corrélées avec la coloration conventionnelle des lames de P. falciparum à différents moments de 0 à 4 h à 48 à 52 h (Fig. S7).

Dans ce travail, nous démontrons pour la première fois que notre cytophone bicolore avec des diodes laser avancées a le potentiel de développement ultérieur en tant que nouvelle plate-forme de diagnostic pour la détection et l'identification des Plasmodium-iRBC, ainsi que de plusieurs autres marqueurs PA intrinsèques associés à d'autres maladies d'importance mondiale. Nous avons démontré qu'un cytophone avec deux petites diodes laser (longueurs d'onde : 808 nm et 915 nm) peut identifier Hz, un sous-produit de dégradation de l'hème généré par toutes les espèces connues de Plasmodium, sur un fond sanguin et des artefacts. Le sang non infecté a fourni des traces d'AP sans pics d'AP nets transitoires au-dessus du fond sanguin (Fig. 4b, 5a, c, e), tandis que le sang infecté par différentes espèces de Plasmodium, y compris P. falciparum cultivé in vitro, l'espèce humaine la plus répandue et la plus virulente (Figs. 4d – f, 5b) montre clairement la possibilité d'une identification bicolore (par exemple, 808 nm/915 nm ou 671 nm/820 nm) de Hz -pics associés avec un rapport de signal PA spécifique sur un fond de sang normal ou d'artefacts avec d'autres rapports et/ou des signaux typiquement produits à une seule longueur d'onde. Les spectres d'absorption de Hz ont démontré une diminution progressive de l'absorption avec une longueur d'onde accrue dans la plage NIR avec un léger maximum à 670 ± 2 nm, tandis que l'absorption des RBC est légèrement augmentée dans cette plage (par exemple, 700–950 nm [Fig. 1c])32. Les données quantitatives de la parasitémie peuvent être obtenues en comptant les nombres de signaux PA par unité de temps (c'est-à-dire le taux de signal) qui sont associés à des iRBC individuels pendant un certain temps divisé par le volume sanguin passant le point de détection pendant le même temps. Le débit pour calculer un volume sanguin peut être estimé grossièrement pour un vaisseau examiné à partir de la littérature15 ou mesuré directement par les techniques US15 et/ou PA9.

Nous avons en outre démontré que notre intégration de PTM et de PAFC permettait la détection de minuscules nanocristaux Hz simples (environ 100 nm) formés seulement quelques heures (4 h) après l'invasion parasitaire (mérozoïte) des globules rouges, ainsi que des agrégats Hz (Fig. 7, S4-6). En utilisant des techniques de détection conventionnelles, on pensait que Hz n'était détectable qu'après 12 h ou plus pendant jusqu'à 24 h. Seules les méthodes magnéto-optiques (MO) ont démontré un potentiel pour détecter la formation de Hz pendant 6 à 10 heures46. De plus, selon une analyse récente47, la vitesse de cristallisation in vivo, étape importante dans la biosynthèse Hz, est estimée à 7 000 hèmes/s. Tenant compte du fait qu'il y a environ 6 à 10 millions d'hèmes dans un seul Hz, la formation de Hz pourrait théoriquement commencer dès 15 à 24 min après l'invasion. Si nos données repoussent le moment de la formation de Hz dans les iRBC, nous devrons peut-être reconsidérer la physiologie de la croissance précoce des parasites immédiatement après l'invasion, ainsi que l'utilité potentielle des plates-formes avancées PTM et Cytophone pour comprendre la dynamique de Hz sur le cycle de vie complet de 48 heures. Nous suggérons que le cytophone pourrait avoir le potentiel de diagnostiquer le paludisme au début de l'infection au stade sanguin14,15, ainsi qu'à de faibles densités de parasites, tout en étant également potentiellement utile dans les études d'efficacité et de viabilité des médicaments in vivo23.

Nous avons constaté que la durée de vie de Hz en circulation est relativement longue (jusqu'à 24 h avant sa clairance notable par le système réticulo-endothélial sans dégradation du signal) (Fig. S2), tandis que d'autres agents (par exemple, les NP de mélanine, les cellules de mélanome, les colorants et les bactéries) sont généralement éliminés en un temps beaucoup plus court (10 min à quelques heures)9. La cinétique Hz générée biologiquement a été explorée dans le paludisme murin et humain et a démontré que Hz, une fois libéré, est rapidement phagocyté, avec Hz intracellulaire présent dans ces phagocytes jusqu'à ce qu'ils quittent la circulation. Notamment, notre plate-forme PAFFC multimodale intégrée permet l'identification du parasite et de l'emplacement Hz dans les iRBC par coïncidence temporelle des signaux correspondants ou de manière extracellulaire dans le plasma grâce à la présence de signaux uniques de Hz (Figs. 4g, 5d)14. Nous pensons que la même plate-forme peut être utilisée pour l'identification de Hz dans les monocytes et les neutrophiles après rupture post-schizonte des iRBC, conduisant ensuite à la libération de Hz libre dans le plasma puis à son engloutissement par les phagocytes (Fig. 7d). En particulier, les neutrophiles et les monocytes peuvent être identifiés par marquage avec des anticorps contre les marqueurs CD11 et CD15, respectivement, ou en combinaison. Bien que ces utilisations soient destinées à des modèles animaux, il est à espérer qu'à l'avenir, l'ICG conjugué ou les nanoparticules d'or à faible toxicité approuvées pour une étude pilote chez l'homme20 pourront être utilisées pour la localisation de Hz dans différents compartiments vasculaires. De plus, nous visons à tirer parti de ces données pour optimiser la capacité PAFC in vivo à distinguer le Hz intraérythrocytaire du Hz libre et du Hz phagocyté. En revanche, l'élimination des Hz libres de la circulation ne prend que quelques jours48, ce qui minimise le risque de fausse positivité.

Comme nous l'avons noté, à l'aide d'un faisceau laser à balayage spatial, la plate-forme Cytophone peut identifier la distribution spatiale des iRBC adhérant à la paroi du vaisseau. Bien que nos données soient préliminaires, nous émettons l'hypothèse que cela pourrait représenter un phénomène bien connu au cœur de la pathogenèse du paludisme, en particulier chez P. falciparum, connu sous le nom de séquestration. La séquestration des iRBC se produit dans le système vasculaire périphérique, ainsi que dans plusieurs tissus, et bien que cela ait été largement décrit dans des études post-mortem murines et humaines, des données limitées ont démontré que de tels processus se produisent in vivo sans l'utilisation d'étiquetage. D'autres travaux sont en cours dans ce domaine, notamment en comparant les résultats des comptages iRBC dans les veines et les artères15.

Peut-être que le plus critique dans le développement ultérieur de la nouvelle plate-forme Cytophone serait la capacité du dispositif à différencier les espèces de Plasmodium. Étant donné que différentes espèces peuvent avoir des spectres d'absorption légèrement différents, il pourrait être possible de différencier les espèces de Plasmodium via la sélection de la longueur d'onde laser appropriée. De plus, différentes espèces produisent différentes tailles et formes de nanocristaux Hz33. Étant donné que la forme d'onde du signal PA dépend de la taille de la cible2,3, cela peut être une autre façon d'identifier différentes espèces. Bien que nous n'ayons pas encore testé le nouveau Cytophone sur diverses espèces de paludisme humain, nos données démontrent de manière concluante la capacité du PAFC à détecter l'espèce humaine la plus importante, P. falciparum. En effet, les signaux générés semblaient plus robustes que ceux des échantillons murins ex vivo de P. yoelii. Nous prévoyons que le PAFC sera en mesure de détecter toutes les espèces, comme l'ont démontré d'autres dispositifs basés sur Hz, et une étude supplémentaire est en cours pour différencier les espèces en fonction des paramètres ci-dessus.

Le cytophone arc-en-ciel (c'est-à-dire multicolore) comporte des diodes laser multispectrales avec de nombreuses longueurs d'onde discrètes actuellement disponibles allant de 630 à 1650 nm ainsi qu'un mode codé par couleur dans le temps9,19,20, qui ouvre des opportunités uniques pour la cytométrie en flux in vivo multicolore (jusqu'à 30 à 40 couleurs simultanément) de plusieurs cibles. En effet, bien que nous ayons appliqué cette nouvelle plateforme au paludisme dans cette étude, les données obtenues (par exemple, Fig. 3, 4, 5, S3), ainsi que nos résultats précédemment publiés avec des lasers conventionnels9,12,16,17,18,19,20,21,43,44,45,46,49, indiquent que notre plateforme Cytophone avec des diodes laser aussi petites que quelques mm peut avoir un certain potentiel pour le diagnostic sans étiquette du mélanome, de la bactériémie, de la drépanocytose anémie (p. ex., hémoglobinopathies), accident vasculaire cérébral, complications liées au COVID-19 (p. ex., coagulation), différentes formes d'Hb, y compris l'oxy-, la désoxy- et la métha-Hb (méthémoglobinémie)19 et certains troubles sanguins associés à un transport d'oxygène inadéquat et à la thalassémie. Bien que les diodes laser aient une énergie d'impulsion inférieure, en moyenne, par rapport aux lasers solides, la haute sensibilité du Cytophone, ainsi que les logiciels avancés et les algorithmes de traitement du signal, compensent au moins en partie sinon entièrement cette limitation. De plus, les progrès dans le développement de puissants réseaux de diodes laser avec une énergie d'impulsion allant jusqu'à 1 à 2 mJ37 réduiront considérablement l'impact de cette limitation pour les applications cliniques. Alors que les données in vivo présentées ici sont largement limitées au paludisme murin, nos données prometteuses in vitro sur P. falciparum nous ont conduits à lancer une première étude pilote chez l'homme avec le cytophone arc-en-ciel. D'autres travaux évalueront la capacité de Cytophone à détecter/distinguer Plasmodia d'autres agents pathogènes érythrocytaires tels que Babesia et Bartonella, ce qui, selon nous, sera réalisable, étant donné qu'aucun de ces deux derniers n'est connu pour produire de l'hémozoïne.

Nous avons précédemment démontré que les signaux PA (avec des largeurs typiques de 0,2 à 0,3 µs) ont un délai acoustique bien distinct (0,5 à 2 µs) des objets circulants dans les vaisseaux sanguins qui sont capturés par le transducteur au-dessus de la peau par rapport aux signaux PA de fond de la couche de peau pigmentée21. Ainsi, le mode de détection résolu en temps dans Cytophone nous a permis d'éliminer l'influence du fond de pigmentation de la peau sur la sensibilité du PAFC. En d'autres termes, ce mode, associé à des algorithmes de traitement rapide du signal, rend les données PA tolérantes à la pigmentation de la peau. Nous avons également utilisé à la fois un animal in vivo (Fig. 4a) et un modèle fantôme de vaisseau composé de tubes en plastique et de fantômes de peau38 avec une couche de mélanine à la surface du fantôme pour évaluer l'impact de la couche de peau sur les lectures de PAFC.

En conclusion, un cytophone avec des diodes laser à impulsions multispectrales à code couleur temporel et un traitement du signal à haute vitesse et résolu dans le temps surmonte les limitations précédentes des techniques de sonorisation, en particulier le PAFC associé à l'utilisation de lasers solides, en raison de la complexité technique, de la grande taille, du coût élevé et d'une longueur d'onde utilisée dans la plupart des applications. Nos résultats préliminaires démontrent la faisabilité d'un cytophone portable, potentiellement à piles, avec des diodes laser. Le Cytophone peut surveiller en continu, en temps réel ou examiner périodiquement la circulation sanguine pour détecter l'apparition des parasites quelques heures après l'invasion. La profondeur du cytophone est bien dans la capacité documentée des techniques d'imagerie PA in vivo conventionnelles pour évaluer les vaisseaux sanguins humains relativement profonds (jusqu'à 3 à 5 cm)2,3,4,5,6,7,8,9. Cependant, ces techniques utilisant des plates-formes de microscopie et de tomographie sont relativement lentes, ce qui rend difficile la détection des mouvements rapides (3 à 10 cm/s même dans des vaisseaux de 1 mm de profondeur), des GRi circulants et d'autres cibles, en particulier dans les gros vaisseaux profonds. Nos données précédentes avec des lasers solides à répétition d'impulsions élevées et maintenant avec des diodes laser suggèrent que la plate-forme Cytophone basée sur PAFC avec une résolution acoustique peut fournir une détection à grande vitesse et une identification spectrale d'objets en circulation d'origines différentes dans des vaisseaux sanguins relativement profonds (1–2 cm) et larges (4–6 mm) avec des vitesses d'écoulement allant jusqu'à 10–20 cm/s9,12,21. La capacité unique d'interroger ces vaisseaux tout en ciblant le processus de formation de Hz, au cœur de toutes les espèces de Plasmodia, offre la promesse d'un diagnostic du paludisme pan-espèce très rapide, non invasif et sans étiquette. Profitant de la capacité de dépister de plus grands volumes de sang en circulation, la sensibilité du cytophone peut en outre permettre la détection du grand réservoir d'individus asymptomatiques, une avancée qui pourrait aider à améliorer à la fois le contrôle du paludisme et son élimination éventuelle. De plus, en couplant les données de cette étude avec nos précédents travaux PAFC, nous prévoyons que la plate-forme multicolore Cytophone peut permettre la détection et l'identification de plusieurs maladies, ce qui en fait un outil portable non invasif prometteur dans un large éventail de contextes mondiaux.

La configuration Cytophone à base de PAFC multicolore (Fig. 1a, 2a – c) est équipée de deux diodes laser pulsées (MM25004, MM25005, Quantel Laser, France) avec des longueurs d'onde de 808 nm et 915 nm (Fig. 2c), des largeurs d'impulsion de 27 ns, une fréquence de répétition des impulsions de 1 à 3 kHz et des énergies d'impulsion de 140 μJ et 110 μJ, respectivement. Chaque laser possède 20 émetteurs d'une longueur totale de 5 mm et une taille d'émetteur individuel de 8 × 200 µm. Les deux diodes laser avaient des angles de divergence de sortie de 40 degrés pour ce que l'on appelle «l'axe rapide» et de 10 degrés pour «l'axe lent» sans composants optiques supplémentaires37,38. Deux miroirs ont été utilisés pour combiner les rayonnements laser dans la même direction de propagation. Le seul miroir était en argent (PF10-03-P01, Thorlabs Inc) pour refléter le rayonnement laser de la diode 808 nm pour éventuellement coïncider avec la diode laser 915 nm utilisant un miroir dichroïque (Di02-R830-25 × 36, Semrock, IDEX Health & Science, LLC). Les faisceaux laser combinés ont ensuite été transformés en faisceau linéaire focalisé par une lentille sphérique (LA1274-B, longueur focale de 40 mm, Thorlabs Inc.) suivie d'un condenseur cylindrique asphérique (ACL2520-B, longueur focale de 20 mm, Thorlabs Inc.). La taille finale du faisceau laser était de 1, 8 mm × 65 μm contrôlée périodiquement avec une caméra CMOS (DCC1645C-HQ, Thorlabs, Inc.). Les énergies d'impulsion après la sortie du système optique ont été ajustées à 80 μJ, ce qui était suffisant pour notre application. L'énergie laser a été contrôlée à l'aide d'un wattmètre optique PM100USB, capteur S314C (Thorlabs, Inc.).

Les ondes acoustiques induites par laser dans les échantillons ont été détectées avec un transducteur cylindrique focalisé sur mesure (fréquence centrale : 51,1 MHz, distance focale de 6 mm, résolution acoustique latérale de 65 μm). Le transducteur était fixé sur une platine de positionnement XYZ indépendante pour permettre un réglage au micromètre près de sa position. L'étage Z indépendant a été utilisé pour ajuster la lentille optique dans la direction Z afin de maximiser l'amplitude du signal PA. Pour obtenir des signaux PA égaux des deux diodes laser, nous avons d'abord équilibré les énergies des deux diodes laser, puis utilisé l'étage Z indépendant pour ajuster l'échantillon à des points optimaux pour les foyers acoustiques et optiques en déplaçant l'étage dans la direction Z. En conséquence, des signaux PA maximaux égaux provenant d'objets avec une absorption similaire (par exemple, une bande noire) sur les deux longueurs d'onde de la diode laser ont été obtenus. Un gel à ultrasons conventionnel a été utilisé pour le couplage acoustique. Un générateur d'impulsions standard a été utilisé pour générer un signal pour piloter les diodes laser, et un signal synchronisé résultant a été envoyé à la carte d'acquisition de données (ATS9350, Alazar Technologies, Inc., Canada). Les signaux PA ont été amplifiés par un préamplificateur (AH-2010-100, Precision Acoustics Ltd, Royaume-Uni).

Les principes du PAFFC intégrant les modules PAFC et FFC ont été décrits en détail ailleurs14. En bref, la configuration a été construite sur une plate-forme de microscope Nikon Eclipse E400 (Nikon Instruments Inc., États-Unis) avec trois lasers nanosecondes (0,6 à 8 ns) à taux de répétition d'impulsion élevé (1–10 kHz) avec les longueurs d'onde correspondantes de 532 nm, 671 nm, 820 nm, 1060 nm et 1064 nm pour la détection PA et avec une diode laser CW488 nm pour la détection de fluorescence. Nous avons utilisé un laser à fibre Yb YLPM-0.3-A1-60–18 (IPG Photonics Corp.) fonctionnant à une longueur d'onde de 1 060 nm, une fréquence d'impulsion de 1 à 10 kHz et une largeur d'impulsion de 0,8 à 10 ns. L'énergie laser a été contrôlée avec un wattmètre (PM100USB, tête S314C, Thorlabs, Inc.). Les signaux du photodétecteur (PDA10A, 150 MHz, Thorlabs, Inc.) ont déclenché le matériel d'acquisition de données. Pour former le faisceau laser en une ligne étroite (6,5 μm × 780 μm) traversant le vaisseau sanguin fantôme ou réel dans un modèle animal, nous avons utilisé une combinaison de lentilles asphériques (C560TME-C) et cylindriques (LJ1598-L1-C) (Thorlabs, Inc.).

Les ondes acoustiques induites par laser ont été détectées par des transducteurs à ultrasons personnalisés à focalisation cylindrique avec un élément sensible à la pression en fluorure de polyvinylidène de 28 µm avec une réponse en fréquence à large bande dans la plage de 0,2 à 32 MHz et une distance focale de 6 mm. Le transducteur a été monté sur une platine XYZ pour permettre un réglage précis de la position. Un PC a été utilisé pour enregistrer les signaux des transducteurs, qui ont été amplifiés par un amplificateur (modèle 5662B, 50 kHz - 4 MHz, Panametrics). Une carte de conversion analogique-numérique, ainsi que les logiciels LabVIEW et MATLAB, ont permis à la configuration de collecter les signaux. Les signaux de fluorescence du tube photomultiplicateur ont été échantillonnés à une fréquence de 4 MHz et sous-échantillonnés à 10 kHz, avec une moyenne de 400 points. Un logiciel personnalisé a été utilisé pour analyser les deux signaux, qui ont été présentés sous forme de traces de signal avec le temps d'apparition, les amplitudes, les formes et les largeurs pour chaque pic supérieur au niveau de fond.

Le principe général du système PTM a été décrit en détail ailleurs34,35,36. En bref, la plate-forme technique d'imagerie PTM confocale à double faisceau (pompe-sonde) colinéaire était basée sur une plate-forme de microscope IX73 (Olympus America, Inc., Central Valley, PA) avec différents lasers à fréquence d'impulsion élevée (1–10 kHz), nanosecondes (5–10 ns) à longueurs d'onde fixes (532/671/820/1064 nm) qui utilisaient une combinaison de lentilles et de fibres optiques pour fournir des lumières laser aux échantillons. Ceci a été réalisé à l'aide d'un multiplexeur de division de longueur d'onde à 3 longueurs d'onde (WDM-RGB46HF, Thorlabs, Newton, NJ) qui combinait les faisceaux d'un laser CW 473 nm (pour l'excitation par fluorescence), de lasers CW 532 nm et d'impulsions (pour le pompage PT et l'excitation par fluorescence) et d'un laser CW 635 nm (sonde PT) dans une fibre monomode. Selon l'application, ce schéma permet à l'utilisateur de basculer entre les sources laser à pompe pulsée et CW pour l'imagerie PT sans compromettre l'alignement du système. Tout d'abord, nous avons utilisé des schémas de pompage conventionnels avec un laser CW fonctionnant à 532 nm. L'intensité du laser a été modulée à l'aide d'un modulateur électro-optique (EOM-NR-C4, Thorlabs, Newton, NJ) à une fréquence de 100 kHz. Les phénomènes PT résultant de l'absorption de la lumière laser de pompage ont été détectés par modulation de l'intensité du faisceau de sonde à l'aide d'une photodiode avec un amplificateur de verrouillage (SR530, Stanford Research Systems, Sunnyvale, CA). Deuxièmement, un laser pulsé de 532 nm (modèle LUCE 532 ; largeur d'impulsion, 5 ns ; fréquence d'impulsion, 10–30 kHz ; Bright Solutions, Italie) a été utilisé pour induire des effets PT linéaires et non linéaires dans l'échantillon. L'intensité de ce laser a été modulée via le même modulateur électro-optique pour changer rapidement l'énergie d'impulsion entre les impulsions en utilisant des signaux PT comme rétroaction pour éviter d'endommager l'échantillon. Pour fournir une configuration PT confocale, un trou d'épingle de photodétecteur a été positionné sur un plan situé à une distance de Rayleigh du "plan de taille" du faisceau de sonde. Ainsi, le trou d'épingle permet la détection d'effets de lentille thermique hautement localisés dans des cibles absorbantes individuelles tout en éliminant l'influence des signaux PT flous. Pour l'imagerie 3D, des images PT successives ont été acquises sur des plans x-y parallèles répartis le long de l'axe z. Pour valider les données PT et rendre le système plus universel, nous avons intégré le PTM avec les méthodes PA, de transmission et de fluorescence en utilisant le PTM confocal avec des modules de microscope à fluorescence confocale et le même sténopé pour la sélection spatiale des faisceaux de fluorescence et de sonde ainsi que des agents de contraste multimodaux PT-fluorescence. En particulier, le module fluorescent a été utilisé pour acquérir l'autofluorescence cellulaire et la fluorescence induite par laser à partir du cytoplasme et de la membrane P. yoelii 17X GFP + globules rouges infectés (en utilisant un canal 575/15 nm avec un laser d'excitation à 532 nm).

Un SEM JSM-7000F (JEOL USA, Peabody, MA) avec un canon à électrons à émission de champ a été utilisé dans cette étude, équipé d'un système EDS (EDAX Inc, Mahwah, NJ). Pour l'imagerie SEM, deux méthodes de préparation d'échantillons ont été utilisées : 1) une poudre sèche de cristaux Hz a été mise en suspension dans une solution d'éthanol. Quelques gouttes de la suspension ont été déposées sur un disque en aluminium de 12,2 (diamètre) × 10 mm (épaisseur) (Ted Pella, Inc, Redding, CA), et 2) la même poudre sèche a été saupoudrée sur une grille TEM recouverte de carbone trouée (SPI Supplies, West Chester, PA). Les images TEM ont été collectées par un JEM-2100F avec un canon à électrons à émission de champ (JEOL USA, Peabody, MA), qui était également équipé d'un système EDAX EDS. Les cristaux de Hz ont été mis en suspension dans de l'éthanol et dispersés avec précaution par agitation douce. Quelques gouttes de suspension Hz ont été déposées sur des grilles TEM en cuivre de 200 mesh recouvertes de carbone (SPI Supplies, West Chester, PA). Ces grilles ont été séchées pendant une heure avant l'analyse MET.

Les animaux ont été utilisés conformément à un protocole approuvé par le Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux de l'Université de l'Arkansas pour les sciences médicales (UAMS). Les souris femelles C57BL/6 et Foxn1(nu/nu) (The Jackson Laboratory, Inc.) ont été infectées avec 105 stade sanguin Plasmodium yoelii 17XNL GFP+ parasités par injection intrapéritonéale. Des souris C57BL/6 non infectées ont été utilisées comme témoins négatifs. Au cours des expériences, les souris ont été anesthésiées par inhalation d'isoflurane à 1,2 % et placées sur le dos sur une platine chauffée à 37 °C pour un suivi in ​​vivo. Les vaisseaux choisis pour l'étude avaient un diamètre d'environ 50 à 70 µm à une profondeur de 150 à 200 µm dans l'oreille de la souris. Les transducteurs et les pointes optiques ont été placés doucement au-dessus de la peau au point de détection et ajustés en temps réel en optimisant les alignements pour des signaux PA maximaux et stables. Un gel à ultrasons (Aquasonic Clear, Parker Labs, Inc.) a été utilisé pour le couplage acoustique entre le transducteur et la peau. Du sang de souris a été prélevé à partir de vaisseaux caudaux pour des tests in vitro à l'aide d'une coloration au Giemsa de frottis sanguins fins et d'une microscopie à fluorescence. Pour PAFFC (ci-dessus), nous avons prélevé du sang de l'artère ventrale et de la veine latérale de la queue chez des souris anesthésiées à l'aide d'une aiguille 28G et d'une seringue de 1 cc avec du citrate de sodium comme anticoagulant. Des frottis sanguins ont été préparés puis examinés sur des lames de verre en utilisant des échantillons de sang prélevés sur des souris saines et infectées, fixés avec du méthanol à 100 % et séchés à l'air. Les souris ont été infectées par les parasites exprimant la GFP, tandis que les souris non infectées ont servi de contrôle. Le nombre de signaux PA par seconde a été analysé pour estimer le stade du parasite sanguin.

Dans des expériences sélectionnées, du sang humain de volontaires a été utilisé conformément aux protocoles approuvés par le comité d'examen institutionnel de l'université de Yale. Un consentement éclairé a été obtenu chez tous les sujets. Toutes les méthodes ont été réalisées conformément aux directives et réglementations en vigueur. L'étude a été réalisée conformément aux directives ARRIVE.

La détection PA in vitro d'objets absorbant la lumière qui coule a été réalisée sur un fantôme de vaisseau sanguin dynamique construit en interne38,39. Il s'agissait de plastisol de chlorure de polyvinyle avec des nanoparticules de TiO2 modélisant le biotissu avec des propriétés de diffusion et d'absorption adéquates, une couche de mélanine représentant la peau pigmentée, des tubes de verre et de plastique de différents diamètres et profondeurs, et un module d'écoulement pour pomper des objets en mouvement avec des vitesses comprises entre 0,5 et 5 cm/s. En particulier, un tube de verre cylindrique d'un diamètre de 0,78 mm (Sutter Instrument, BF100-78–10) agissant comme un vaisseau sanguin d'une profondeur de 0,5 à 2 mm a modélisé l'application médicale typique du PAFC. Pour imiter l'écoulement des cellules et des particules, nous avons utilisé 1) des billes magnétiques de différentes tailles et d'absorption spécifique dans la gamme NIR (Fig. 1c) ; 2) CBC rouges représentant les agrégats de RBC dans le sang ; 3) billes de silice transparentes de 100 µm sous forme de fantômes CBC blancs ; 4 agrégats ICG absorbant préférentiellement à 808 nm ; et 5) Hz disponible dans le commerce. Plus précisément, une suspension Hz synthétique dans une solution PBS à des concentrations de 10 µg/mL, 1,0 µg/mL et 0,1 µg/mL a été utilisée comme fantôme de peau pigmentée et d'iRBC. La suspension Hz dans du PBS a été dérivée d'une suspension mère de 5 mg/mL en ajoutant 1 mL de PBS à 5 mg de cristaux Hz dans son flacon d'origine comme indiqué par le fabricant (Invivo Gen). Pour calibrer le système PAFC, la trace a également été surveillée après administration de billes magnétiques (Spherotech Inc.) avec différents diamètres moyens. Le même volume (2 µL) de suspension de billes magnétiques (1 % p/v de différentes distributions granulométriques moyennes : 5,25 µm, 8,22 µm et 23,7 µm) a été mis en suspension dans 8 mL de PBS.

Etudes murines. À l'aide de la plate-forme PAFFC, nous avons tenté une détection précoce du Hz natif ex vivo avec l'espèce de rongeur non létale Plasmodium P. yoelii 17XNL (MR4, BEI Resources Repository). Pour fournir une vérification secondaire de la détection Hz en temps réel ex vivo, une lignée de parasites étiquetés par la protéine fluorescente verte (GFP) (P. yoelii 17XNL:PyGFP) a été utilisée, permettant l'utilisation d'un canal fluorescent dans la plate-forme PAFFC. Le sang infecté d'une souris Foxn1(nu/nu) obtenu 3 à 4 h après l'infection a été analysé en même temps que la procédure PAFFC et par examen microscopique d'un frottis sanguin mince. Plus précisément, 100 µL d'un échantillon de sang infecté par GFP+ P. yoelli ont été dilués dans 100 µL de milieu RPMI 1640 dans un tube d'héparine. Un échantillon de 1 µL de cette solution a ensuite été dilué en série dans du PBS dans les rapports suivants 1:102, 1:103, 1:104 et 1:105, et chaque échantillon dilué a été analysé par PAFFC avec un laser pulsé à 671 nm pour l'excitation PA et un laser CW à 473 nm pour l'excitation par fluorescence.

Des échantillons congelés de P. falciparum (souche de laboratoire 3D7) ont été décongelés à l'aide d'une procédure saline en plusieurs étapes (BEI Resources, Manassas, VA). Des plaques de P. falciparum ont été maintenues en culture continue à 2 % d'hématocrite avec des érythrocytes humains et ont été incubées à 37 °C dans du milieu RPMI 1640 supplémenté sous une atmosphère contenant 5 % de dioxyde de carbone et 1 % d'oxygène. Une fois que les cultures de parasites ont atteint > 5 % de parasitémie, elles ont été synchronisées avec une solution de sorbitol à 5 % pour inclure uniquement les parasites au stade anneau post-infection de 0 à 12 h. Ces plaques de culture ont été surveillées jusqu'à ce que les parasites aient atteint le stade schizonte tardif, moment auquel un gradient de Percoll de 60 % a été utilisé pour séparer les parasites au stade schizonte. Les parasites schizontes collectés ont été réintroduits dans une nouvelle plaque de culture avec des érythrocytes humains non infectés et laissés incuber pendant 4 h. Ces cultures de P. falciparum ont été synchronisées avec une solution de sorbitol à 5 ​​% pour créer des plaques contenant uniquement des parasites au stade anneau post-infection de 0 à 4 h. Les cultures synchronisées de P. falciparum ont été surveillées pendant les 48 heures suivantes avec un échantillonnage en série de la culture toutes les 6 heures pour préparer des lames de microscopie de frottis sanguins fins et épais pour analyse. Neuf échantillons au total ont été prélevés sur les cultures synchronisées, y compris les points de temps suivants après l'infection des érythrocytes : 0–4 h, 6–10 h, 12–16 h, 18–22 h, 24–28 h, 30–34 h, 36–40 h, 42–46 h et 48–52 h.

Les souris ont été suivies in vivo tous les 1 à 3 jours de 10 min à 1 h, selon le stade de parasitémie. Le taux de signal PA a été calculé comme le nombre de signaux par unité de temps (seconde ou minute). Pour égaliser les variations de données dues à la taille des vaisseaux, à la position de la surveillance quotidienne, ainsi qu'à l'individualité de la souris, des vaisseaux similaires d'un diamètre d'environ 50 µm dans l'oreille de la souris ont été sélectionnés et utilisés. Les amplitudes crête à crête des formes d'onde PA ont ensuite été tracées, et les points au moins 3σ au-dessus des niveaux de fond ont été considérés comme les signaux PA. Toutes les mesures ont été effectuées au moins trois fois, et les moyennes de tous ces points de données ont été tracées dans les figures. Les données collectées (comptes M) ont été tracées en tant que M ± SD. Les analyses de signaux et statistiques ont été effectuées dans MATLAB (MathWorks, Inc.). La moyenne des données collectées avec des barres d'erreur standard a été calculée et un niveau de signification α = 0,05 a été utilisé à des fins de comparaison.

Toutes les données associées à cette étude sont présentes dans l'article ou les documents supplémentaires.

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Ce travail a été financé en partie par les fonds de dotation de l'UAMS. Nous remercions I. Pelivanov (Univ. De Washington) pour avoir fourni les transducteurs cylindriques et sphériques focalisés personnalisés. Nous remercions Amy Bei (Yale School of Public Health) pour son aide avec les protocoles de culture et de synchronisation de P. falciparum. La souche 17XNL:PyGPF de Plasmodium yoelii a été obtenue auprès de BEI Resources, NIAID, NIH, MRA-817, avec la contribution d'Ana Rodriguez. Nous remercions Sergey Nikitin pour son aide lors des tests initiaux des diodes laser. La plupart des travaux expérimentaux ont été effectués à l'UAMS et en partie à l'Université de Yale. Après avoir accompli ce travail, HJJ a déménagé au Département de physique de l'Université de Bagdad, Al-Jadriya, Bagdad, Irak.

Les auteurs suivants ont contribué à parts égales : Hind J. Jawad et Aayire C. Yadem.

Ces auteurs ont supervisé conjointement ce travail : Sunil Parikh et Vladimir P. Zharov.

Center for Integrative Nanotechnology Sciences, Université de l'Arkansas à Little Rock, 2801 S. University Ave., Little Rock, AR, 72204, États-Unis

Hind J. Jawad, Aayire C. Yadem, Fumiya Watanabe et Alexandru S. Biris

Arkansas Nanomedicine Center, Université de l'Arkansas pour les sciences médicales, 4301 W. Markham St., Little Rock, AR, 72205, États-Unis

Hind J. Jawad, Aayire C. Yadem, Yulian A. Menyaev, Mustafa Sarimollaoglu, Dmitry Nedosekin et Vladimir P. Zharov

Département de physique, Université de Bagdad, Al-Jadriya, Bagdad, 10071, Irak

Hind J.Jawad

École de santé publique de Yale, 60 College St, New Haven, CT, 06520, États-Unis

Jillian N. Armstrong et Sunil Parikh

Département de microbiologie et d'immunologie, Université de l'Arkansas pour les sciences médicales, 4301 W. Markham St., Little Rock, AR, 72205, États-Unis

Jason S. Stumhofer

Collège de médecine, Université de l'Arkansas pour les sciences médicales, Little Rock, AR, 72205, États-Unis

Dmitri Nedosekin

Département d'oto-rhino-laryngologie, Faculté de médecine, Université de l'Arkansas pour les sciences médicales, Little Rock, AR, 72205, États-Unis

James Y. Suen & Vladimir P. Zharov

CytoAstra, LLC, 401 South Cedar St., Little Rock, AR, 72205, États-Unis

James Y. Suen & Vladimir P. Zharov

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VPZ a conçu l'étude et rédigé l'article ; HJJ, ACY, YAM et JYU ont développé des plateformes techniques ; Logiciel développé par MS et traitement du signal ; HJJ, ACY, YAM ont réalisé une étude liée à l'AP ; ACY et DN ont réalisé une étude liée au PT ; JSS a fourni un modèle animal de paludisme, JNA et SP ont fourni des échantillons pertinents pour l'homme et les évaluations associées ; FW et ASB ont effectué la caractérisation des échantillons ; SP a édité le papier. Tous les auteurs ont lu et approuvé la version finale de l'article.

Correspondance à Vladimir P. Zharov.

VPZ, JYS et UAMS ont un intérêt financier dans la technologie discutée dans cette publication. VPZ et JYS ont tous deux des intérêts financiers dans CytoAstra, LLC, qui a autorisé la technologie présentée dans ce travail de recherche. Ces intérêts financiers ont été examinés et approuvés conformément aux politiques sur les conflits d'intérêts de l'UAMS. Les autres auteurs n'ont aucun conflit d'intérêts lié à ce manuscrit.

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Réimpressions et autorisations

Jawad, HJ, Yadem, AC, Menyaev, YA et al. Vers un cytophone portable arc-en-ciel avec des diodes laser pour le diagnostic global des maladies. Sci Rep 12, 8671 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-11452-w

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Reçu : 06 octobre 2021

Accepté : 18 avril 2022

Publié: 23 mai 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-022-11452-w

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