Ultrarapide

Rapports scientifiques volume 12, Numéro d'article : 11935 (2022) Citer cet article

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Les méthodes basées sur l'irradiation ultraviolette (UV) utilisées pour l'inactivation virale ont fourni une voie importante ciblant le virus du coronavirus-2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SARS-CoV-2). Un problème majeur avec la technologie d'inactivation UV de pointe est qu'elle est basée sur des lampes UV, qui ont une efficacité limitée, nécessitent une puissance élevée, de fortes doses et de longs temps d'irradiation. Ces inconvénients limitent l'utilisation des lampes UV dans les systèmes de filtrage de l'air et d'autres applications. Pour répondre à ces limitations, nous rapportons ici la fabrication d'un dispositif comprenant un laser UV nanoseconde pulsé à 266 nm couplé à une cavité d'intégration (LIC) composée d'un matériau réfléchissant les UV, le polytétrafluoroéthylène. Les cavités d'inactivation des lampes UV précédentes étaient basées sur des parois polies avec des réflexions spéculaires, mais les circuits intégrés UV à réflexion diffuse n'ont pas été explorés en profondeur pour l'inactivation des virus. Nos résultats montrent que le dispositif LIC peut inactiver plusieurs virus respiratoires, dont le SRAS-CoV-2, à un temps d'irradiation efficace d'environ 1 ms, avec une efficacité supérieure de > 2 ordres de grandeur par rapport aux lampes UV. L'amélioration démontrée de la cavité de 3 ordres de grandeur par rapport à l'exposition directe est cruciale pour le développement de systèmes efficaces de purification de l'air et de l'eau par UV en temps réel. À notre connaissance, il s'agit de la première démonstration de l'application LIC pour une large inactivation virale avec une grande efficacité.

Pour lutter contre l'apparition de la pandémie mondiale du syndrome respiratoire aigu sévère coronavirus-2 (SRAS-CoV-2), divers nanomatériaux aux propriétés physiques et chimiques ajustables ont été développés pour la vaccination et le traitement des patients1,2. De plus, des purificateurs d'air assistés par oxydation photoélectrochimique ont été développés comme outils potentiels pour contrôler l'exposition intérieure au SRAS-CoV-23. Cependant, les virus pandémiques se propagent dans l'air et les surfaces et il est donc urgent de développer des méthodes rapides et efficaces pour inactiver les particules virales sur les surfaces et dans l'air, en particulier dans les lieux publics tels que les hôpitaux, les aéroports, les magasins, etc. contre cette pandémie et d'éventuelles pandémies futures.

Divers protocoles de désinfection par la lumière sont actuellement validés pour les échantillons de surface, d'air et d'eau, ainsi que pour les équipements de protection individuelle4. L'irradiation aux UV en tant que méthode efficace et sans contact d'inactivation des agents pathogènes viraux est utilisée depuis longtemps, principalement sous la forme de lampes à mercure à basse pression ou de diodes électroluminescentes5,6,7,8. La lumière UVC (dans la plage de 100 à 280 nm) a la plus grande efficacité d'inactivation antimicrobienne et antivirale parmi les différentes plages d'UV, y compris les UVA (315 à 400 nm) et les UVB (280 à 315 nm)9. L'absorption maximale des acides nucléiques est à ~ 265 nm, la lumière UVC causant des dommages en induisant la fusion photochimique de deux pyrimidines adjacentes en dimères liés par covalence, la réticulation ARN-protéine et les dommages moléculaires spécifiques au site10. Le rayonnement UV a été exploré pour le traitement des entérovirus humains, du Zika, de l'hépatite E, de la dengue, du Nil occidental et autres11,12,13,14,15,16,17,18,19 et, récemment, du SARS-CoV-220,21,22,23,24,25,26,27,28. L'efficacité virucide de la lumière UV est influencée par un certain nombre de facteurs, notamment l'agent pathogène cible, l'environnement et le matériel à décontaminer29. De plus, les UV germicides ont été combinés avec un traitement thermique pour la désinfection virale30,31, y compris le SARS-CoV-232. Les problèmes avec les lampes UV comprennent une efficacité limitée, nécessitant une puissance élevée et de longs temps d'irradiation (fortes doses), ce qui prend du temps et ne convient pas à une utilisation dans de nombreux systèmes de climatisation, où l'air ne passe par une lampe UV que pendant de très courtes périodes de temps. Les inconvénients du chauffage comprennent une faible efficacité et de grandes pertes de chaleur dans l'environnement, qui nécessitent des efforts de refroidissement supplémentaires et, par conséquent, augmentent le coût de l'inactivation.

De plus, il a été rapporté que des impulsions laser ultracourtes dans le visible (Vis) à 425 nm et le proche infrarouge (NIR) à ~ 800 nm inactivent les virus33,34,35. Il a été suggéré que la diffusion Raman stimulée impulsive, entraînant l'agrégation des protéines de la capside virale, était le principal mécanisme d'inactivation33. Cependant, l'efficacité d'inactivation de l'irradiation Vis-NIR pulsée est inférieure à celle des lampes UVC germicides. Des lasers UVB pulsés, tels que le laser nanoseconde excimer 308 nm, ont également été utilisés pour l'inactivation virale, mais ont montré une faible efficacité, similaire à Vis-NIR36. Des rendements élevés ont été obtenus en utilisant des lasers UVC pulsés tels que l'excimère à 193 nm et le Nd:YAG de quatrième harmonique à 266 nm37,38. Une irradiation laser pulsée UV nanoseconde à 266 nm a révélé le mécanisme non linéaire à deux quantums de la réticulation ARN-protéine dans l'inactivation du virus de l'encéphalomyélite équine vénézuélienne (VEE) avec une augmentation de plus d'un ordre de grandeur du rendement quantique par rapport à la lampe UVC à 254 nm38. Cela contraste avec la nature linéaire à un photon du mécanisme de formation de dimère de pyrimidine conventionnel qui est présent à la fois dans l'irradiation par laser UV pulsé et par lampe UV. L'ablation par laser UV pulsé est basée sur une combinaison de plusieurs mécanismes, y compris la décomposition thermique et photochimique, qui peuvent augmenter l'efficacité de l'inactivation virale au-delà des lampes UV conventionnelles. Les impulsions UV contiennent plus d'énergie par unité de temps et peuvent pénétrer les solutions plus loin que la lumière UV continue37. D'autre part, les impulsions UV correspondent à une absorption plus forte que les impulsions Vis ou NIR, ce qui entraîne une inactivation plus efficace.

L'absorption de la lumière peut être améliorée en couplant des lasers UV pulsés à des cavités d'intégration (CI). Les circuits intégrés typiques ont une géométrie sphérique et des parois constituées de matériaux de diffusion diffuse hautement réfléchissants39,40. La diffusion de la lumière lambertienne depuis les murs génère des champs uniformes à l'intérieur des circuits intégrés et de grandes longueurs de chemin optique efficaces, qui ont été utilisées pour la détection et les applications spectroscopiques41,42,43,44. Même si diverses boîtes et cavités UV ont déjà été utilisées pour l'inactivation des agents pathogènes45, les propriétés virucides des CI n'ont pas été beaucoup explorées. La nature de diffusion diffuse des circuits intégrés présente un avantage par rapport à la diffusion spéculaire des cavités conventionnelles en fournissant une plus grande plage d'angles d'éclairage qui peuvent réduire le blindage des virus par les microparticules. Par conséquent, nous avons émis l'hypothèse que le laser UV pulsé couplé aux circuits intégrés peut détruire le virus plus efficacement en un temps réduit. Pour tester cette hypothèse, nous avons développé ici un nouveau dispositif d'inactivation de virus basé sur un laser UV nanoseconde pulsé de 266 nm couplé à une cavité d'intégration, appelé Laser Integrating Cavity Device (LICD). Nous avons examiné l'inactivation des coronavirus humains, tels que le SRAS-CoV-246 et le coronavirus 229E (HCoV-229E)47, ainsi que le virus respiratoire syncytial (VRS)48. Nos résultats montrent que le LICD peut inactiver 99,9 % du virus à une irradiation totale efficace d'environ 1 ms, ce qui représente > 3 ordres de grandeur d'augmentation de l'efficacité. À notre connaissance, il s'agit de la première démonstration de l'utilisation d'une cavité d'intégration laser UVC pulsée pour l'inactivation du coronavirus humain, y compris le SRAS-CoV-2.

Deux méthodes différentes d'exposition au laser ont été étudiées : (1) une exposition directe du virus au faisceau laser UV (Fig. 1a) ; (2) une exposition indirecte du virus à l'irradiation laser UV lorsqu'il est placé à un endroit aléatoire à l'intérieur de l'enceinte LICD (Fig. 1b). Nous avons conçu le LICD en couplant le laser UVC pulsé à la nanoseconde de 266 nm à une enceinte IC cylindrique constituée d'un revêtement en polytétrafluoroéthylène (PTFE) hautement réfléchissant les UV49,50. Les schémas détaillés et les dimensions spatiales du LICD sont illustrés à la figure S1. Pour l'exposition directe, un flacon en plastique a été placé horizontalement comme indiqué sur la figure 1a et une gouttelette de virus a été maintenue au fond du flacon. Pour l'exposition LICD, un flacon a été placé au hasard au fond et le second flacon a été placé au hasard sur la paroi latérale de l'enceinte, comme illustré à la Fig. 1c.

Inactivation des virus à l'aide d'une cavité d'intégration laser UVC ultrarapide. (a) Schéma de l'exposition directe au laser UVC pulsé sur une gouttelette de solution virale dans un flacon. ( b ) Schéma de l'exposition LICD de l'irradiation laser UVC sur une gouttelette de virus placée à l'intérieur de la cavité à l'emplacement de l'ouverture a2. (c) Photographie de la cavité avec une gouttelette de virus à l'intérieur d'un flacon. ( d ) Photographie de la cavité remplie de lumière laser UVC et de la réflexion de la fluorescence du 2e passage et de la diffusion multipasse sous forme de deux points lumineux sur une carte blanche, placée à l'ouverture a2. ( e ) Image de hauteur AFM d'une feuille de PTFE utilisée comme paroi de cavité LICD à réflexion diffuse. (f, g) Images de hauteur AFM des virions HCoV-229E non traités (U) et traités au laser UVC (T). La barre d'échelle est de 0,3 µm. ( h ) Hauteur et largeur moyennes des virions HCoV-229E non traités et traités.

Une fois que le faisceau laser incident est réfléchi par la paroi interne de l'enceinte, la lumière diffusée de manière diffuse subit de multiples réflexions, remplissant uniformément tout le volume. L'efficacité de diffusion diffuse peut être estimée en observant la luminosité des deux spots de fluorescence sur une carte blanche placée à l'ouverture de sortie de la cavité (Fig. 1d). Le spot du 2ème passage est directement réfléchi depuis la paroi de la cavité par le faisceau laser incident. La tache de la diffusion multipasse est d'une luminosité similaire, indiquant une réflectivité diffuse élevée des parois de la cavité. Le revêtement PTFE a une réflectivité diffuse omnidirectionnelle de > 93 % en raison de la structure poreuse.

Nous avons étudié les propriétés morphologiques des parois IC en utilisant la microscopie à force atomique (AFM). La figure 1e montre l'image de hauteur AFM de la feuille de PTFE utilisée comme matériau réfléchissant pour le CI. Les irrégularités observées sont dues à la présence de nanoparticules et de pores mis en évidence par des lignes pointillées blanches sur la figure S2a. L'analyse AFM de la figure S2b a montré la taille moyenne des particules de 0,44 µm et la taille moyenne des pores de 1,86 µm. Les profils AFM d'une particule typique et d'un pore sont représentés respectivement sur les figures S2c et S2d. Pour observer les changements morphologiques causés par l'exposition au laser UVC pulsé, nous avons effectué des mesures AFM sur les virions HCoV-229E non traités (non irradiés) et traités (irradiés par laser UVC pulsé direct) (Fig. 1f, g). Le virus traité a été irradié pendant 30 min. Le traitement de 30 min a été choisi pour assurer l'inactivation complète (plus de 99,99 %, voir ci-dessous). Pour l'analyse statistique, dix virions ont été sélectionnés à partir d'échantillons traités et non traités. La hauteur moyenne des virions non traités était d'environ 31 nm, tandis que les virions traités avaient une hauteur moyenne d'environ 19 nm (Fig. 1h). Les profils de largeur latérale ont montré la largeur moyenne des virions non traités ~ 159 nm et des virions traités ~ 82 nm (Fig. 1h).

Les profils de hauteur AFM des exemples typiques des virions non traités et traités sont présentés dans les figures S3a et S3b. Ces résultats indiquent un rétrécissement des particules virales après exposition à des impulsions laser UVC ultracourtes, confirmant la contribution du mécanisme d'ablation à l'inactivation du virus.

Pour étudier l'inactivation du coronavirus, nous avons utilisé une exposition directe au laser UVC nanoseconde de 266 nm pour inactiver le virus HCoV-229E. Une gouttelette de virus de 6 ul dans du PBS a été placée dans un flacon comme décrit ci-dessus. Les temps d'irradiation laser de 1, 5, 10 et 30 s correspondent aux doses de 3,5, 17,6, 35,3 et 105,9 mJ/cm2. Lors de l'exposition directe au laser UVC, la réplication du HCoV-229E a été complètement inactivée (réduction de 99,9 %) après 4 s d'exposition, ce qui correspond à une dose de 15,6 ± 0,3 mJ/cm2, mesurée par qPCR pour le pic 229E (S) (Figure S4a) et les transcrits de la nucléocapside (N) (Fig. 2a) après 72 h d'infection dans des cellules Calu-3. Pour étudier les effets de l'exposition indirecte au laser UVC sur la réplication virale à l'intérieur de l'enceinte IC, nous avons effectué l'exposition LICD de la gouttelette de virus HCOV-229E dans du PBS placé à l'intérieur d'un flacon à deux positions aléatoires à l'intérieur de l'IC (indiqué sur la figure S1) avec les temps d'irradiation de 10, 30, 120 et 1800, ce qui correspond à 0,05, 0,15, 0,6. Après la dose UV de 0,63 ± 0,02 mJ/cm2, la réplication virale HCoV-229E a été inactivée (réduction de 99,9 %), mesurée par qPCR pour les protéines 229E S (Figure S4b) et N (Fig. 2b) après 72 h d'infection dans des cellules Calu-3 (Figure S5).

Le virus HCoV-229E a été exposé au laser UVC pulsé direct (a) et à la cavité (b) pendant les durées indiquées. Les cellules Calu-3 ont été traitées 24 h après l'ensemencement avec les groupes indiqués de 229E (3 MOI). À 72 h après l'infection, l'ARN a été extrait et la qPCR a été réalisée. Le changement de pli moyen ± SEM, par rapport au contrôle négatif (NC), est indiqué (N = 3). Une ANOVA à 1 facteur et un test post-hoc de Dunnett ont été utilisés pour déterminer la signification par rapport à 0 s. Survie du HCoV-229E en fonction du temps d'irradiation UV via une exposition directe (c) et une cavité (d). *p < 0,05, **p < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001.

La figure 2c montre le tracé de survie log-linéaire de la cinétique d'inactivation directe, où N0 et N sont les concentrations initiale et finale des unités virales infectieuses déterminées à partir de l'analyse qPCR. Seule la partie linéaire du graphique a été ajustée en accord avec l'approche commune51 telle que décrite dans la section Méthodes. L'ajustement de régression linéaire a entraîné la constante de vitesse d'inactivation k = 0,443 ± 0,006 mJ/cm2. La figure 2d montre le tracé de survie LICD et l'ajustement de régression linéaire avec la constante de vitesse d'inactivation k = 10,9 ± 0,4 mJ/cm2. Ces résultats indiquent que l'exposition directe et LICD au laser UVC pulsé éradique la capacité virale à se répliquer dans les cellules hôtes. Cependant, le LICD est d'un ordre de grandeur plus efficace car il nécessite une dose plus faible pour obtenir une inactivation similaire.

Ensuite, nous avons effectué une exposition directe du laser UVC nanoseconde de 266 nm pour inactiver le SARS-CoV-2. Nous avons utilisé une gouttelette de virus de 23 μl dans du PBS placée dans un flacon pour les expositions directes et LICD comme décrit ci-dessus. Les durées d'irradiation de 30, 60, 120 et 300 s correspondent respectivement à des doses de 105,9, 211,8, 423,6 et 1059 mJ/cm2. Lors de l'exposition directe au laser UVC, la réplication du SRAS-CoV-2 a été inactivée (99,9 %) après 3 min et une exposition à une dose de 715 mJ/cm2, mesurée par microscopie à fluorescence (Fig. 3a–d) et qPCR pour les protéines SARS-CoV-2 S (Figure S6a) et N (Fig. 3i) après 48 h d'infection dans des cellules Calu-3. Nous avons ensuite effectué l'exposition LICD du SRAS-CoV-2 avec des temps d'irradiation de 30, 60, 120 et 300 s correspondant à des doses d'exposition de 0,15, 0,3, 0,6 et 1,5 mJ/cm2, respectivement. Après la dose UV de 0,60 ± 0,02 mJ/cm2, la réplication virale a été inactivée (réduction de 99,9 %), lorsqu'elle a été mesurée par microscopie fluorescente (Fig. 3e – h) et qPCR pour les transcrits SARS-CoV-2 S (Figure S6b) et N (Fig. 3j) après 48 h d'infection dans des cellules Calu-3. L'infection par le SRAS-CoV-2 entraîne généralement une augmentation pathologique de la protéine inflammatoire TNF-α46. Cependant, après exposition à la fois à l'irradiation laser UVC directe (Fig. 3k) et LICD (Fig. 3l), l'infection par le SRAS-CoV-2 provoque une expression significativement moindre du TNF-α dans les cellules Calu-3. L'analyse de régression linéaire de la courbe de survie pour l'exposition directe de la Fig. 3m a donné une constante de vitesse d'inactivation de k = 0,00965 ± 0,00004 mJ/cm2. L'ajustement de régression linéaire pour le LICD sur la figure 3n a entraîné la constante de vitesse d'inactivation de k = 11, 2 ± 0, 1 mJ / cm2. Cela a montré que la LICD était trois ordres de grandeur plus efficace que l'exposition directe.

Le virus SARS-CoV-2 a été exposé aux durées d'irradiation indiquées de la lumière laser UVC directe ou à cavité. Les cellules Calu-3 ont été infectées 24 h après l'ensemencement avec les groupes indiqués de CoV-2 (0,1 MOI). ( a – h ) Les images ont été prises 48 h après l'infection à l'aide du microscope EVOS (Thermo Fisher). 200X. Barre d'échelle = 200 µm. ( i – j ) Expression de la protéine SARS-CoV-2 N dans les cellules Calu-3. À 72 h après l'infection, l'ARN a été extrait et la qPCR a été réalisée. Le changement de pli moyen ± SEM, par rapport au contrôle négatif (NC), est indiqué (N = 3). Une ANOVA à 1 facteur et un test post-hoc de Dunnett ont été utilisés pour déterminer la signification par rapport à 0 s. ( k – l ) Expression du marqueur inflammatoire dans les cellules Calu-3 après une infection par le SRAS-CoV-2. Pour le contrôle négatif, le CoV-2 a été exposé à la lumière UVC sous une baguette portative pendant 2 min. À 48 h après l'infection, l'ARN a été extrait et la qPCR a été réalisée. Le changement de pli moyen ± SEM, par rapport au contrôle négatif (NC), est indiqué (N = 3). Une ANOVA à 1 facteur et un test post-hoc de Dunnett ont été utilisés pour déterminer la signification par rapport à 0 s. Survie du SRAS-CoV-2 en fonction du temps d'irradiation via l'exposition directe (m) et la cavité (n). *p < 0,05, **p < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001.

Nous avons ensuite utilisé le surnageant de culture cellulaire Calu-3 de l'expérience précédente pour réinfecter un nouveau lot de cellules Calu-3 avec le SRAS-CoV-2. Le surnageant de culture cellulaire contenant le virus SARS-CoV-2 a été exposé au laser direct ou au LICD pour inactiver le virus. Les temps d'irradiation laser étaient de 60 et 120 s avec des doses de 211,8 et 423,6 mJ/cm2 pour l'exposition directe et de 0,3 et 0,6 mJ/cm2 pour le LICD. Lors de l'exposition directe au laser UVC, la réplication du SRAS-CoV-2 a été complètement inactivée à une dose de 211,8 mJ/cm2, mesurée par microscopie à fluorescence (Fig. 4a – c) et qPCR pour le transcrit du SRAS-CoV-2N (Fig. 4e) après 48 h d'infection dans des cellules Calu-3. Après la dose UV de 0,6 mJ/cm2, la réplication virale a été inactivée dans le LICD, lorsqu'elle a été mesurée par microscopie fluorescente (Fig. 4d) et qPCR pour les transcrits du SARS-CoV-2N (Fig. 4f) après 48 h d'infection dans des cellules Calu-3. Ces résultats montrent qu'après exposition au laser UVC pulsé direct ou LICD, les échantillons de coronavirus, y compris le SRAS-CoV-2, ne sont plus capables de provoquer une infection productive dans les cellules en culture.

Réinfection de cellules Calu-3 avec le surnageant de culture de cellules Calu-3 infectées par le SRAS-CoV-2 qui ont été exposées à une lumière laser UVC directe ou de cavité (Fig. 3). ( a – d ) Les images ont été prises 48 h après l'infection à l'aide du microscope EVOS (Thermo Fisher). 200X. Barre d'échelle = 200 µm. ( e – f ) Expression de la protéine SARS-CoV-2 N dans les cellules Calu-3. À 48 h après l'infection, l'ARN a été extrait et la qPCR a été réalisée. Le changement de pli moyen ± SEM, par rapport au contrôle négatif (NC), est indiqué (N = 3). Une ANOVA à 1 facteur et un test post-hoc de Dunnett ont été utilisés pour déterminer la signification par rapport à 0 s. *p < 0,05, **p < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001.

Pour tester le LICD sur un virus respiratoire différent, nous avons ensuite exposé le virus RSV exprimant la protéine fluorescente rouge (RSV-RFP) à un laser UV pulsé nanoseconde de 266 nm avec des temps d'irradiation de 1, 5 et 15 s avec des doses correspondantes de 3, 5, 17, 6 et 52, 9 mJ / cm2 (figures S7a-h). Une dose de 17,6 mJ/cm2 a entraîné une inactivation virale complète dans les cellules Hep2 à 72 h après l'infection lorsqu'elle a été observée par microscopie à fluorescence. Le virus RSV-RFP a ensuite été exposé au LICD, qui a inactivé avec succès le RSV-RFP dans les cellules Hep-2 à 72 h d'infection lorsqu'il a été exposé à des doses aussi faibles que 0,3 mJ/cm2, cependant, une dose de 0,05 mJ/cm2 a également inactivé la plupart du virus (figures S7i-p).

À titre de mesure de contrôle, nous avons également exposé directement le virus RSV-RFP à un laser UVB nanoseconde pulsé à 337 nm (Figure S8). L'irradiation laser UVB n'a eu aucun effet inhibiteur sur la réplication virale RSV-RFP dans les cellules Hep-2. Ces résultats confirment l'utilisation du rayonnement laser pulsé UVC pour l'inactivation virale. Nous avons effectué des mesures de contrôle supplémentaires à l'aide de deux sources de lampes UVC différentes pour l'inactivation virale, l'unité Stratalinker (Figure S9) et une baguette portative (Figure S10). Les deux lampes UVC ont pu inactiver la réplication virale RSV-RFP dans les cellules Hep2 à 72 h après l'infection avec un temps d'irradiation de 5 s et une dose de 68,5 mJ/cm2, lorsqu'elles ont été observées par microscopie à fluorescence. Cependant, une efficacité d'inactivation supérieure de deux ordres de grandeur a été obtenue en utilisant le LICD (dose de 0,6 mJ/cm2, tableau 1).

Le tableau 1 présente les résultats de l'analyse de régression linéaire de la cinétique d'inactivation du HCoV-229E et du SARS-CoV-2. Les constantes de taux d'inactivation k ont ​​été obtenues à partir des courbes de survie décrites dans la section Méthodes. Le tableau 1 montre également la dose d'UVC nécessaire pour inactiver 90 % (D90), 99 % (D99) et 99,9 % (D99.9). D99.9 représente "l'inactivation complète" nécessitant 715 mJ/cm2 pour le SRAS-CoV-2 en utilisant l'exposition directe, alors que seulement 0,6 mJ/cm2 en utilisant le LICD. Cette différence est quantifiée par le facteur d'amélioration de la cavité (EF) de 1160 (tableau 1) donné par l'équation EF dans la section Méthodes.

L'inactivation complète (99,9 %) de HCoV-229E a nécessité 15,6 mJ/cm2 pour l'exposition directe, alors que seulement 0,63 mJ/cm2 était nécessaire en utilisant le LICD (tableau 1), ce qui a donné un EF de 25 en raison de la cavité. La constante de vitesse d'inactivation pour le LICD de k = 10,9 mJ/cm2 était similaire à celle du SRAS-CoV-2 pour le LICD. Cependant, une constante de vitesse plus élevée de k = 0,44 mJ/cm2 pour l'exposition UVC pulsée directe de HCoV-229E a été obtenue par rapport à k = 0,01 mJ/cm2 pour le SRAS-CoV-2. Cette différence pourrait être attribuée à une taille de gouttelette plus petite (6 μl) et à des différences structurelles et morphologiques.

La constante de vitesse d'inactivation obtenue pour l'exposition au LICD k = 11,2 mJ/cm2 est supérieure d'un ordre de grandeur aux constantes de vitesse précédemment observées pour la plupart des virus ssRNA utilisant des lampes UVC à 254 nm et ~ 5 fois plus grande que celle prévue pour le SARS-CoV-251. D'autre part, le k = 0,01 mJ/cm2 observé pour l'exposition directe est inférieur d'un ordre de grandeur aux valeurs typiques de la littérature pour d'autres virus à ARNsb utilisant des lampes à 254 nm. Cette différence pourrait s'expliquer par les différentes conditions expérimentales telles que la taille relativement importante des gouttelettes de la solution de SARS-CoV-2 (23 μl) et l'absence d'agitation. Ces effets pourraient entraîner une atténuation de la lumière dans l'échantillon et des valeurs k inférieures. Notez que ces effets, cependant, n'affectent pas les valeurs EF, qui montrent l'augmentation de l'efficacité d'inactivation due à l'effet IC.

Une différence majeure entre la lampe UVC et une exposition au laser UVC pulsé du point de vue des applications réside dans le temps d'irradiation effectif, qui est beaucoup plus court pour le laser pulsé. La durée totale d'exposition au laser par unité de temps peut être obtenue en multipliant la durée d'impulsion en nanosecondes par le taux de répétition des impulsions. Cela se traduit par un temps d'irradiation total effectif pour inactiver les coronavirus HCoV-229E et SARS-CoV-2 d'environ 1 ms en utilisant le LICD, alors qu'il n'est que d'environ 0,1 ms pour inactiver le RSV. Des temps d'inactivation similaires sont nécessaires pour l'exposition directe mais avec des doses plus importantes en raison de la différence des zones d'illumination du direct (~ 0,2 cm2) par rapport au LICD (~ 200 cm2). En raison des différences dans l'organisation du génome et la composition des protéines non structurelles, ces trois virus nous permettent de démontrer la capacité d'inactivation à large spectre du laser UVC pulsé et du LICD.

Dans ces études, nous avons effectué une inactivation rapide des virus à l'aide d'un laser UVC nanoseconde pulsé de 266 nm en vue de développer un large dispositif LIC antiviral. Pour tester ce nouveau système, nous avons utilisé 3 types de virus différents, dont HCoV-229E, RSV-RFP et SARS-CoV-2. Une comparaison du LICD, fabriqué à l'aide d'un matériau de diffusion diffuse hautement UV PTFE, avec l'exposition directe du faisceau laser UVC, a démontré une inactivation virale efficace après exposition au LICD. Le temps nécessaire à l'inactivation pourrait être encore réduit en augmentant la puissance du laser, en utilisant des éléments optiques supplémentaires et en améliorant les propriétés de réflexion diffuse du dispositif avec des matériaux réfléchissants plus avancés. De plus, au-delà de l'inactivation virale, l'application du LICD peut être étendue à d'autres agents pathogènes tels que les bactéries52,53,54 et les moisissures55. Les progrès technologiques dans le développement des lasers UV sont envisagés pour réduire les coûts et rendre la technologie LICD largement disponible dans un proche avenir. L'application du LICD aux systèmes de purification de l'air et de l'eau bénéficiera de l'efficacité accrue de l'inactivation. Les climatiseurs à base de LICD peuvent être utilisés dans des espaces clos tels que des avions, des magasins et des bureaux. Les systèmes de purification d'eau à base de LICD peuvent être utilisés dans les environnements domestiques et industriels. Les conduites d'eau revêtues de PTFE seraient utiles en conjonction avec leurs propriétés antisalissures pour le traitement des eaux usées56.

Le LICD peut être utilisé dans les lieux publics en raison de la protection fermée du volume exposé aux UVC par la cavité. En général, l'exposition de la peau aux rayons UVC peut provoquer des dommages oxydatifs soit par l'absorption directe des UV, soit par les espèces réactives de l'oxygène57. Cependant, il a été rapporté que de faibles doses de lumière UVC lointaine (207–222 nm) peuvent être inoffensives pour les tissus humains exposés7. De plus, des nanoparticules d'aluminium ont été proposées comme agents de protection dans une approche médicale quantique basée sur le rayonnement UV pour réduire considérablement le risque de photodommage des tissus sains, tout en inactivant les agents pathogènes58.

Les lignées cellulaires (Calu3 et Hep2) ont été achetées auprès de l'American Type Culture Collection (ATCC, Virginia USA) et pas plus de 25 passages. Les cellules ont été cultivées dans un incubateur humidifié à 37°C dans une atmosphère à 5% de CO2 (dioxyde de carbone). Les cellules ont été cultivées dans des plaques traitées pour la culture tissulaire dans le milieu de culture cellulaire complet approprié [HEP2 = DMEM (GE Healthcare) contenant 10 % de sérum bovin fœtal (FBS) (Atlanta Biologicals) et 1 % de pénicilline/streptomycine (GE Healthcare)] [Calu3 = MEM (GE Healthcare) contenant 20 % de FBS, 1 % d'acides aminés non essentiels (GE Healthcare), 1 % de pyruvate de sodium 100 mM (Gibco) et 1% pénicilline/streptomycine].

Trois virus différents ont été utilisés dans ces expériences. Protéine fluorescente rouge (RFP) exprimant le virus respiratoire syncytial (RSV-RFP), le coronavirus humain 229E (HCoV-229E) et le SRAS-CoV-2. Le HCoV-229E a été obtenu auprès de BEI Resources, NIAID, NIH : Human Coronavirus, 229E, NR-52726. Le SRAS-CoV-2 nous a été fourni par le Dr Pei-Yong Shi de la branche médicale de l'Université du Texas, Galveston, TX, États-Unis59. La souche de RSV utilisée dans toutes les expériences (RSV-RFP) était une souche A2 recombinante exprimant un marqueur fluorescent rouge, mKate2, ainsi que la protéine F de la souche clinique Line 19 (rA2-KL19F). La manipulation et le stockage du RSV-RFP et du HCoV-229E, y compris toutes les procédures expérimentales, ont été effectués dans un laboratoire de niveau de biosécurité 2 (BSL-2). La manipulation, le stockage et les expériences utilisant le SARS-CoV-2 ont été effectués dans un laboratoire BSL-3. Pour toutes les expériences, une monocouche de cellules Hep2 (RSV-RFP) ou Calu3 (SARS-CoV-2 et HCoV-229E) à 80 % de confluence a été infectée avec diverses concentrations du virus MOI indiqué (comme indiqué dans les légendes des figures). Les cellules ont ensuite été incubées avec l'inoculum viral dans Opti-MEM (Life Technologies) pendant 2 h à 37 ° C. Après cela, le milieu infectieux a été remplacé par du milieu de croissance frais. La microscopie fluorescente (Keyence BZ-X800 ou EVOS) a été utilisée pour imager les cellules, puis les culots cellulaires ont été collectés pour l'analyse de l'ARN.

L'ARN cellulaire total a été extrait des culots cellulaires à l'aide de Trizol (Thermo Fisher Scientific) selon le protocole du fabricant. L'ARN a été quantifié à l'aide du Nanodrop (Thermo Fisher Scientific). Un microgramme d'ARN a ensuite été soumis à une transcription inverse à l'aide du kit de transcription inverse d'ADNc Maxima (Thermo Fisher Scientific) selon le protocole du fabricant. La qPCR réalisée sur l'ADNc a été utilisée pour quantifier les niveaux d'expression relatifs de certains gènes à la β-actine comme contrôle. L'analyse en temps réel a été effectuée à l'aide de BlazeTaq SYBR Green qPCR Mix 2.0 (Genecoepia), selon le protocole du fabricant, dans un thermocycleur Bio Rad CFX-384 à l'aide d'amorces obtenues auprès d'Integrated DNA Technologies (IDT). Les données ont été analysées à l'aide de calculs ΔΔCt et l'expression de tous les gènes a été normalisée à l'expression de la β-actine en tant que gène domestique. Le changement de pli moyen ± SEM, par rapport au contrôle, a ensuite été calculé. L'analyse des données a été réalisée à l'aide du logiciel CFX Maestro (Bio-Rad).

Nous avons construit la cavité d'intégration (IC) de forme cylindrique en utilisant une feuille de PTFE poreux à haute réflectance (Thorlabs) de 0,75 mm d'épaisseur qui a montré une réflectance UVC > 93 %. Les diagrammes schématiques et les dimensions spatiales sont illustrés à la figure S1.

L'augmentation du chemin optique dans le CI peut être estimée en utilisant l'approche de Fry et al.39,42. La distance moyenne entre les réflexions à l'intérieur d'une cavité d'intégration \(\overline{d }\) = 4,1 cm est donnée par \(\overline{d }\) = 4\(\frac{V}{S}\), où V est le volume de la cavité et S est la surface. La longueur moyenne du trajet à l'intérieur du CI, L = 63 cm a été calculée par L = 4\(\frac{V}{S(1-\rho )}\), où \(\rho\) = 0,935 est la réflectivité du CI estimée à partir de la réflectivité du PTFE à 266 nm. Le facteur d'amélioration de la cavité (EF) pour chaque virus a été calculé par EF = \(\frac{{k}_{cavité}}{{k}_{direct}}\), où \({k}_{direct}\) et \({k}_{cavité}\) est la constante de vitesse d'inactivation pour l'exposition directe et LICD, décrite ci-dessous.

Les sources UV suivantes ont été utilisées : (i) La source UVC pulsée était un laser pulsé nanoseconde Nd:YAG de 266 nm (JDS Uniphase NanoLaser™) avec une puissance moyenne de 1 mW, une durée d'impulsion temporelle d'environ 1 ns et une fréquence de répétition de 10 kHz. (ii) La source UVB pulsée était un laser à azote de 337 nm (VSL-337ND) avec une puissance moyenne de 5,2 mW, une durée d'impulsion temporelle < 4 ns et un taux de répétition de 10 Hz. (iii) La lampe UVC Cw (Stratalinker® UV Crosslinker 1800) avait 5 ampoules, 8 W chacune, avec une longueur d'onde de 254 nm. (iv) La lampe UVC Cw (Handheld Wand, Clear-Raze™) avait une ampoule de 18 W avec une longueur d'onde de 254 nm.

Les résultats des expériences d'inactivation ont été analysés à l'aide des données d'expression relative des gènes qPCR (Figs. 2 et 3). Les paramètres de régression linéaire du tableau 1 ont été calculés à l'aide de la cinétique de premier ordre donnée par ln(N/N0) = -k D, où N/N0 est la fraction de survie, N est l'expression génique relative à chaque dose UV (D) et N0 est l'expression génique relative à dose nulle. Les expériences ont été réalisées en 3 répétitions pour HCoV-229E et 4 répétitions pour SARS-CoV-2. La constante de vitesse d'inactivation, k (mJ/cm2), a été calculée pour chaque souche virale et pour les expositions directes et LICD. Les doses de réduction de charge pour inactiver 90 % (D90), 99 % (D99) et 99,9 % (D99.9) du virus sont données par, D90 = \(\frac{-\mathrm{ln}[1-0,9]}{k}\), D99 = \(\frac{-\mathrm{ln}[1-0,99]}{k}\), et D99,9 = \(\frac{ -\mathrm{ln}[1-0,999]}{k}\).

Les gouttes virales ont été inactivées à l'aide de formol tamponné au phosphate à 10 % pendant 20 min et lavées à l'aide d'une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Des mesures de microscopie à force atomique (AFM) (OmegaScopeR, Horiba Scientific) ont été effectuées à l'aide d'une pointe Si (Micromash) en mode tapotement avec une distance moyenne pointe-échantillon de 20 nm sur le virus déposé sur un substrat SiO2/Si par coulée de goutte. Une zone de balayage de 2 µm * 2 µm a été choisie pour l'AFM, qui comprenait plusieurs virions, parmi lesquels 10 virions ont été sélectionnés pour calculer et comparer la hauteur et la largeur des virions traités et non traités.

Les expériences ont été répétées trois fois avec trois répétitions dans chaque expérience. Lors de la comparaison de plusieurs groupes, la signification statistique de chaque expérience a été déterminée à l'aide de l'analyse de variance (ANOVA) et du test post hoc de Dunnett, *p < 0,05, **p < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001. Les calculs ont été effectués et les graphiques produits à l'aide du logiciel Prism 6.0 (GraphPad). Les graphiques des résultats montrent la moyenne et les barres d'erreur représentent la moyenne plus ou moins l'erreur standard de la moyenne.

Les ensembles de données générés et/ou analysés au cours de l'étude en cours sont disponibles sur demande auprès d'un auteur correspondant.

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Ce travail est partiellement soutenu par un Senior Research Career Scientist Award à SSM (IK6BX006032) et un Research Career Scientist Award à SM (IK6BX004212) et les Veterans Affairs Merit Review Awards à SSM (BX003685) et SM (BX005490 et BX003413). Bien que ce rapport soit basé sur des travaux soutenus, en partie, par le Department of Veterans Affairs, Veterans Health Administration, Office of Research and Development, le contenu de ce rapport ne représente pas les points de vue du Department of Veterans Affairs ou du gouvernement des États-Unis. De plus, ce travail est en partie soutenu par la subvention de développement de l'Université de Floride du Sud à DVV et les subventions PRRN-Rapid COVID à SSM et à SM

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Sharad Ambardar, Mark C. Howell et Karthick Mayilsamy.

Département de génie médical, Université de Floride du Sud, USF Cherry Drive ISA 6049, Tampa, FL, 33620, États-Unis

Sharad Ambardar & Dmitri V. Voronine

Département des anciens combattants, James A. Haley Veterans Hospital, Tampa, FL, 33612, États-Unis

Mark C. Howell Jr, Andrew McGill, Ryan Green, Subhra Mohapatra et Shyam S. Mohapatra

Département de médecine interne, Morsani College of Medicine, Université de Floride du Sud, 12901 Bruce B Downs Blvd. MDC 2511, Tampa, Floride, 33612, États-Unis

Mark C. Howell Jr, Andrew McGill, Ryan Green et Shyam S. Mohapatra

Département de médecine moléculaire, Morsani College of Medicine, Université de Floride du Sud, 12901 Bruce B Downs Blvd. MDC 2525, Tampa, Floride, 33612, États-Unis

Karthick Mayilsamy, Andrew McGill et Subhra Mohapatra

Département de physique, Université de Floride du Sud, Tampa, FL, 33612, États-Unis

Dimitri V. Voronine

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Recherche documentaire et analyse des données : SA, MCH, RG, ARM, KM Études laser et cavité : SA, MCH, RG, KM, RG, SM, SSM et DVV Analyses d'inactivation virale : SA, MCH, RG, KM, SM, DVV et SSM Rédaction du manuscrit : SA, MCH, RG, ARM, RD, SM, DVV et SSM Tous les auteurs ont lu et accepté la version publiée du manuscrit.

Correspondance à Subhra Mohapatra, Dmitri V. Voronine ou Shyam S. Mohapatra.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Ambardar, S., Howell, MC, Mayilsamy, K. et al. Dispositif à cavité d'intégration laser UV ultrarapide pour l'inactivation du SRAS-CoV-2 et d'autres virus. Sci Rep 12, 11935 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-13670-8

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Reçu : 28 janvier 2022

Accepté : 26 mai 2022

Publié: 13 juillet 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-022-13670-8

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